【摘 要】
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新城疫（Newcastle disease,ND）与禽流感（Avian influenza,AI）是目前危害我国养禽业发展的重要呼吸道疾病。疫苗免疫是其有效的预防手段,免疫抗体监测是评价免疫效果,掌握疫情动态最直接、最有效的方法,因此,免疫抗体水平监测已成为各地养禽场和诊断室的常规监测项目。目前新城疫、禽流感抗体定量检测方法主要为HI与ELISA检测方法,该类方法操作步骤繁琐,耗时长,需要专业人员
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新城疫（Newcastle disease,ND）与禽流感（Avian influenza,AI）是目前危害我国养禽业发展的重要呼吸道疾病。疫苗免疫是其有效的预防手段,免疫抗体监测是评价免疫效果,掌握疫情动态最直接、最有效的方法,因此,免疫抗体水平监测已成为各地养禽场和诊断室的常规监测项目。目前新城疫、禽流感抗体定量检测方法主要为HI与ELISA检测方法,该类方法操作步骤繁琐,耗时长,需要专业人员进行操作,无法实现圈边快速检测,因此建立简便、快速、定量且能实现圈边检测的检测方法对于禽流感、新城疫的防控具有重要意义。本研究利用胶体金免疫层析方法,结合免疫定量速测仪的信号识别,以HI方法为标准,分别建立了NDV与H9 AIV亚型抗体快速定量检测方法。该方法可用于圈边快速检测,为NDV、H9 AIV亚型抗体水平检测及免疫效果评估提供了新的方法。具体研究结果如下:1.目的蛋白的表达纯化分别构建重组原核表达质粒pSmart-HN与pSmart-HA,表达重组蛋白NDV-HN与AIV-H9-HA,纯化获得浓度为1.0 mg/mL的HN蛋白与1.1 mg/mL的HA蛋白。2.检测方法的建立及条件优化本研究采用胶体金免疫层析方法,利用双抗原夹心原理分别建立NDV抗体与H9 AIV亚型病毒抗体快速定量检测方法。NDV抗体定量检测方法最佳反应体系为:吸水垫H5073,金标垫Fusion4,样品垫RB65,包被液为pH 7.2且含2%BSA的PB缓冲液,样品封闭液为PB缓冲液,质控（C）线包被0.5 mg/mL的羊抗兔IgG,包被量为0.9μL/cm,检测线1、2（T1、T2）分别包被0.8 mg/mL与0.6 mg/mL的NDV-HN,包被量为0.9μL/cm;H9 AIV亚型抗体定量检测方法最佳反应体系为:吸水垫H5073,金标垫Fusion4,样品垫Ahlstrom 8964,包被液为pH 7.2且含2%BSA的PB缓冲液,样品封闭液为Tris缓冲液,质控（C）线包被0.5 mg/mL的羊抗兔IgG,包被量为0.9μL/cm,检测线1、2（T1、T2）分别包被1.0 mg/mL与0.8 mg/mL的AIV-H9-HA,包被量为0.9μL/cm。3.检测方法的性能测定用免疫定量速测仪分别测定不同HI效价的标准阳性样品的T1、T2及C线信号值,以HI效价为X轴,以信号比值[（T1+T2）/C]为Y轴,建立标准曲线,NDV抗体快速定量检测方法的曲线方程为y=0.0967x~2-0.5143x+1.2017,相关系数R~2为0.9903,检测卡检测限为2~2,特异性高,检测卡的批内变异系数在6.63-9.07%,批间在7.96-9.81%,保存期为6个月;H9 AIV亚型抗体快速定量检测方法的曲线方程为y=0.3896x-0.6842,相关系数R~2为0.9656,检测卡检测限为2~3,特异性高,检测卡的批内变异系数在2.00-3.80%,批间在2.10-4.18%,重复较好。保存期为6个月。4.检测方法的初步应用用本研究建立的快速定量检测方法对临床血清样品进行了检测,以HI检测为对照,NDV与H9 AIV亚型抗体快速定量检测方法与HI的符合率分别为82.21%与80.56%,表明本研究建立的检测方法可应用于临床样品的检测。
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