肺间质纤维化（Pulmonary Fibrosis）是多种肺间质性疾病的共同结局。其发病率近年呈上升趋势，其预后较差，诊断后的平均生存时间不足5年，致死率高，对人民群众的健康构成严重威胁，目前缺乏有效的根治措施。因此延缓肺间质纤维化进展、降低肺间质纤维化发病率是我国呼吸系统疾病防治所面临的巨大挑战和重大需求。　　尽管间质性肺病的病因机制复杂，肺间质纤维化是其不断进展的共同病理表现与最后通路，主要表现为：炎症因子聚集，血管塌陷，肌成纤维细胞增多进而产生细胞外基质沉积，最终导致肺脏纤维化、肺功能丧失。目前缺乏有效手段阻止肺间质纤维化进展。因此，解析肺间质纤维化分子机制，寻求有效的干预策略，对降低肺间质纤维化的发病率具有重大的临床意义。　　目前，肺间质纤维化的详细分子机制尚不清楚。　　肺间质腔中肌成纤维细胞的大量聚集与肺部血管塌陷是肺间质纤维化的核心环节和重要因素。目前对于肌成纤维细胞来源尚不明确，争议较大。国内外大量研究显示其来源主要包括以下几种途径：上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)；原位的成纤维细胞的转化及循环中的前体细胞等。伴随研究的不断深入，以往研究的热点“EMT”观点因在动物体内无法复制，而受到挑战。新近有学者利用遗传命运图谱技术提出在肺间质纤维化中周细胞(pericyte)是肌成纤维细胞的主要来源。　　周细胞活化后的一个重要效应是：向肺间质腔迁移，并转化为肌成纤维细胞，促进细胞外基质合成。周细胞活化后的另一个重要效应是：导致肺脏微血管塌陷。由此可见：周细胞活化是导致肺间质肌成纤维细胞聚集与肺部微血管塌陷的重要连接点！深入研究周细胞活化机制及其活化后所导致的重要分子效应将为肺间质纤维化的治疗提供新的研究思路和治疗策略。　　周细胞活化的机制是什么目前仍不清楚。相关研究表明血管内皮细胞与周细胞的特殊结构相互分泌的细胞因子如：TGF-β、PDGF配体等进而活化TGF-β、PDGF等通路，最终诱导周细胞转化过程。上述研究表明：多条信号通路的活化是周细胞转化发生的重要基础。但是又是什么调控了这些信号通路的活化？能否找到调控它们活性的共同靶点？　　随着人类基因组计划的完成以及蛋白质组技术的不断发展，糖基化蛋白质组学成为近几年研究的热点。糖蛋白在翻译后必须借助糖基化修饰完成蛋白质功能。核心岩藻糖基化（core fucosylation，CF）是重要的蛋白质糖修饰，是由α-1,6核心岩藻糖转移酶（Fucosyltransferase8，FUT8）催化岩藻糖基由GDP-Fuc转移至糖蛋白N-连接寡糖的核心结构GlcNAc上，形成核心岩藻糖。FUT8是哺乳动物中仅有的一种核心岩藻糖基转移酶，通过调控受体蛋白功能来参与信号转导过程。　　所以我们思考：在肺间质纤维化的进程中，多条信号通路的活化是关键，那么CF修饰是否是调控这些信号通路的共同靶点？　　然而蛋白质CF修饰在肺间质疾病领域的研究尚属空白。我们课题组前期研究发现：发现了TIMP-1在肺、肾间质纤维化中的作用及CF调控肾脏纤维化中TIMP-1。此外，我们课题组的前期实验及国外文献报道：调控周细胞转分化重要通路中的关键受体PDGFβR、TGF-βR均为糖蛋白。　　上述研究结果表明CF修饰可能参与周细胞转化，而且在肌成纤维细胞聚集后产生的细胞外基质沉积可能发挥重要作用，贯穿肺间质纤维化发生发展的全过程。　　我们提出科学假设：CF修饰可能是调控周细胞转化及肺间质纤维化进展中的重要靶点，因此以此为靶点进行干预很可能成为未来治疗肺间质纤维化的新策略。然而，CF修饰在肺间质纤维化进展中的改变是什么？周细胞转化及肺间质纤维化中键蛋白是什么？是否受CF调控？干预CF修饰后是否可以逆转周细胞转化及肺间质纤维化的进展？这些都是尚未解决的科学问题。　　因此，要解决上述科学问题，本实验拟利用体外实验结合体内实验，深入研究CF调控周细胞转化与肺间质纤维化的作用机制，这些信息将有利于我们更加清楚的把握CF修饰调控周细胞转化机制进而解析肺间质纤维化，为发现治疗肺间质纤维化提供更加精准的靶向药物。　　因此本课题拟解决“CF修饰是调控周细胞转化及减轻肺间质纤维化的重要调控点”的观点，为促进糖生物学与肺间质纤维化相互渗透、治疗肺间质纤维化提供全新思路与治疗策略。　　第一部分体外小鼠肺脏周细胞的分离与培养　　目的：　　建立体外小鼠肺脏周细胞分离及培养方法，明确周细胞的生物学特征。　　方法：　　1利用免疫磁珠方法分离纯化小鼠肺脏周细胞,通过倒置相差显微镜观察周细胞的形态。2利用PDGFβR、α–SMA、CD73、Desmin多种周细胞标志物进行免疫荧光鉴定。3应用CCK8方法测定肺脏周细胞生长情况并绘制生长曲线图。　　结果：　　1免疫磁珠分选小鼠肺脏周细胞约12天左右融合，传代后生长及融合速度加快；传代后周细胞生长速度加快，7天左右融合，光镜下观察周细胞形态不规则,呈星形状或不规则形状。2免疫荧光方法鉴定周细胞多种标记物表达阳性（PDGFβR、CD73、Desmin），生理情况下，α-SMA表达阴性。3细胞生长曲线测定周细胞传代后（P1）:第4天进入生长对数期，第8天进入平台期。　　结论：　　1免疫磁珠分选法可获得高纯度和可传代的小鼠肺脏周细胞。2选择原代或者第一代周细胞能够更好地应用周细胞相关的实验。　　第二部分核心岩藻糖基化修饰对周细胞向肌成纤维细胞转化的影响　　目的：　　观察阻抑核心岩藻糖基化修饰能否逆转周细胞向肌成纤维细胞转化。　　方法：　　1体外采用外源性TGF-β1（Transform growth factor-β1，TGF-β1）刺激因子建立周细胞向肌成纤维细胞转化模型，光镜下观察48h后周细胞发生的形态变化。2利用免疫荧光双染的方法确定周细胞及肺脏是否表达核心岩藻糖基化修饰及建立体外、体内纤维化模型后CF修饰的水平表达变化及周细胞向肌成纤维细胞转化过程中核心岩藻糖基化水平、α-SMA及FUT8的表达变化。3体内外分别采用FUT8siRNA及FUT8shRNA技术沉默周细胞及小鼠肺脏内源性FUT8基因，验证FUT8基因表达。4体内研究采用博莱霉素诱导的肺间质纤维化模型，免疫荧光共染方法确定周细胞有无存在迁移及CF对周细胞向肌成纤维细胞转化的影响。　　结果：　　1正常周细胞及肺脏存在中等量核心岩藻糖基化水平，体外加入终浓度5ng/mL的TGF-β1孵育周细胞48h后，免疫荧光结果显示周细胞及肺脏表面CF表达水平明显上调伴随周细胞转分化全过程。2体外建立周细胞转化模型，免疫荧光结果显示周细胞发生转化，α-SMA的表达上调；体内建立博来霉素诱导的肺间质纤维化模型，免疫荧光及免疫印迹结果显示：与正常组相比，肺脏间质腔中PDGFR及α-SMA的表达明显增加（P<0.05）。3 FUT8siRNA瞬时转染周细胞48h后，明显抑制周细胞转化及上述标记蛋白的表达；腺病毒包装FUT8shRNA经尾静脉注射后，抑制肺脏肺核心岩藻糖基化修饰水平后，免疫荧光及免疫印迹显示肺脏α-SMA表达明显下降（P<0.05）。　　结论：　　1在肺间质纤维化模型中，周细胞是肌成纤维细胞的重要来源。2 FUT8催化的核心岩藻糖基化修饰介导了周细胞转分化的全过程，抑制核心岩藻糖基化修饰后可以明显抑制周细胞转化。　　第三部分核心岩藻糖基化修饰调控周细胞转化机制　　目的：　　解析在BLM诱导小鼠肺间质纤维化模型中，CF调控周细胞向肌成纤维细胞转化的机制及肺间质纤维化进程中CF对关键蛋白（PDGFβR、TGF-βRⅠ、p-Erk、p-Smad2/3）蛋白的影响。　　方法：　　1利用外源性TGF-β1诱导周细胞转化体外模型及BLM致小鼠肺间质纤维化体内模型中，应用免疫荧光检测周细胞转化相关的PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信号通路的活化。2体外 FUT8siRNA技术及利用腺病毒包装的FUT8shRNA经尾静脉注射小鼠体内沉默周细胞及肺脏CF后，通过荧光双染及免疫沉淀方法检测PDGFβR、TGF-βRⅠ受体蛋白是否受到核心岩藻糖基化修饰及CF修饰对其PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信号通路中关键蛋白的影响。　　结果：　　1外源性刺激因子TGF-β1（5ng/ml）孵育周细胞48小时后，免疫荧光双染显示周细胞转分化关键受体蛋白PDGFR、TGF-βRI显著升高，其CF修饰水平亦显著升高；PDGFR、TGF-βRI受到CF修饰，FUT8siRNA阻抑核心岩藻糖基化修饰并不影响受体蛋白的表达。2外源性刺激因子TGF-β1（5ng/ml）孵育周细胞48小时后，PDGF、TGF-β信号通路被激活，免疫荧光方法显示下游磷酸化蛋白p-Erk、p-Smad2/3表达明显增加；阻抑核心岩藻糖基化修饰后明显下调p-Erk、p-Smad2/3表达。3体内建立博来霉素诱导的小鼠肺间质纤维化模型，于28天作为造模终点，激活肺间质脏纤维化及周细胞转分化相关的TGF-β、PDGF信号通路，免疫荧光双染、免疫印迹及免疫沉淀显示肺间质纤维化过程中关键蛋白PDGFβR、TGF-βRI表达及CF修饰水平显著升高，同时受到CF修饰；FUT8shRNA阻抑核心岩藻糖基化修饰并不影响受体蛋白的表达，但明显抑制下游磷酸化蛋白p-Erk、p-Smad2/3的表达。　　结论：　　1 PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信号通路的活化参与了周细胞向肌成纤维细胞转化的全过程。2关键受体蛋白PDGFβR及TGF-βRI受到 CF修饰。3阻抑核心岩藻糖基化修饰明显抑制PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信号通路中下游磷酸化蛋白的表达,抑制周细胞转化及肺间质纤维化的进展。　　第四部分核心岩藻糖基化在周细胞转化及肺间质纤维化进展中的修饰特征　　目的：　　探讨核心岩藻糖基化修饰在周细胞转化及肺间质纤维化进程中的变化特征及阻抑CF修饰后对肺脏病理及细胞外基质沉积的保护作用。　　方法：　　1利用外源性TGF-β1诱导周细胞转化体外模型及BLM致小鼠肺间质纤维化体内模型，应用免疫荧光共染及免疫印迹方法检测FUT8与α-SMA蛋白表达变化。2体外利用FUT8siRNA技术及体内利用腺病毒包装的FUT8shRNA经尾静脉注射小鼠体内抑制CF修饰后，应用免疫荧光共染及免疫印迹方法检测抑制CF后对FUT8与α-SMA蛋白表达的影响。3体内建立博来霉素诱导的小鼠肺间质纤维化模型，于28天作为造模终点，建立肺脏纤维化病理，利用腺病毒包装的FUT8shRNA经尾静脉注射小鼠体内，应用病理染色及免疫组化方法检测对CollageⅠ、CollageⅢ的表达变化。　　结果：　　1在外源性TGF-β1诱导周细胞转化体外模型及博来霉素诱导小鼠肺间质纤维化体内模型中，FUT8与α-SMA的表达明显上调且呈正相关。2体外FUT8siRNA及体内FUT8shRNA技术抑制CF表达后，逆转了周细胞转化，FUT8及α-SMA表达明显下调。3博来霉素建立肺间质纤维化小鼠模型后，病理染色显示肺脏失去原有结构，肺间质腔明显增厚，胶原纤维明显增加；免疫组化显示肺脏中CollageⅠ、CollageⅢ表达明显增加。4 FUT8shRNA阻抑体内核心岩藻糖基化修饰后，病理染色显示肺脏恢复原有结构，肺间质腔明显变薄，胶原纤维明显减少；免疫组化显示CollageⅠ、CollageⅢ表达明显下降。　　结论：　　1在周细胞向肌成纤维细胞转化前后受到核心岩藻糖基化的修饰且呈正相关。2周细胞向肌成纤维细胞转化后产生的CollageⅠ、CollageⅢ生物分子蛋白促进了肺间质纤维化的进程,阻断体内核心岩藻糖基化修饰明显抑制细胞外基质沉积，改善肺间质纤维化的病理。