[研究背景]慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染引起的一个全球性的健康问题。全世界约有3.5亿人为HBV慢性感染者,每年约有100-200万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。我国是HBV感染高发地区,人群携带率约9-10%。在CHB基础上的重症化病情笃重,发展迅猛,临床上缺乏特异、有效的治疗手段,除非实施紧急肝移植,绝大部分患者预后不良。世界卫生组织数据指出,每年共有43万新发肝癌病例,其中3/4的病例发生在东南亚地区(包括中国、朝鲜和日本)。我国肝癌的分布与HBV的感染密切相关,临床上约有80%的肝癌患者体内可检测到HBV的感染。肝癌的恶性程度高,生存时间短,死亡率高,临床治疗方法也极为有限。肝癌及CHB的发病机制较为复杂,至今尚未完全阐明。目前认为一定条件下宿主的免疫反应异常是上述疾病发病的关键环节。相关问题的阐明不仅有助于揭示肝癌及慢性乙型肝炎的发病机制,也可为疾病的防治及预后评估提供新的靶点。在20世纪80年代发现FGL2/纤维介素蛋白(Fibrinogen-like protein2(fg12)/fibroleukin)属纤维介素相关蛋白超家族,又称fg12凝血酶原酶或跨膜型fg12(membrane fgl2, mfg12)。 mfg12可表达在巨噬细胞和内皮细胞上,具有丝氨酸蛋白酶活性,直接催化凝血酶原转变成有活性的凝血酶,从而快速启动凝血级联反应。国内外研究已发现,mfg12在一些以微循环障碍为病理生理特征的疾病模型,如暴发性病毒性肝炎、自发性流产、同种及异种移植排斥反应中表达升高。本实验室前期研究发现,mfg12在多种恶性实体肿瘤(如结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌)中有较为广泛的表达,主要分布在恶性肿瘤的实质细胞、肿瘤间质浸润细胞和血管内皮细胞上,并且其表达部位与纤维蛋白沉积具有明显相关性。近期,我们又发现高表达mfg12可促进HCC嫁接瘤生长及血管的新生,同时证实mfg12的表达可活化高侵袭性肝癌细胞系HCCLM6细胞中MAPK途径。这些现象提示mfg12可通过MAPK途径促进肿瘤的生长和血管新生。fg12还有另外一种表达类型即可溶性fg12(Soluble fg12,sfg12)。在小鼠模型中发现sfg12可由Foxp3+调节性T细胞(Tregs)分泌并参与机体免疫调节功能,同时通过fg12-Fc γ RⅡB受体途径抑制T细胞的增殖和骨髓树突状细胞的成熟。在自身免疫性疾病小鼠模型中发现调节性T细胞通过分泌sfg12参与自身免疫性疾病的发展,并且发现sfg12是构成调节性T细胞免疫抑制功能的重要分子。还有研究表明在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染的慢性丙型肝炎患者血浆中sfg12的表达水平明显高于健康人和非活动性酒精性肝硬化患者。[研究目的]1.深入阐明mfg12通过MAPK途径促进肝癌生长、侵袭和血管新生机制,进一步揭示mfg12在肿瘤中的免疫学作用。2.探讨sfg12在CHB患者中免疫调节机制。[研究方法]1.mfg12促进肝癌细胞系HCCLM6嫁接瘤生长,侵袭和血管发生机制的研究1)通过免疫组织化学染色,检测15例人高中低分化肝癌切片中fg12的表达,连续切片染色检测fg12与纤维蛋白沉积的关系；2)用RNA干扰技术建立fg12敲除的人高侵袭性肝癌细胞系HCCLM6细胞模型；3)利用瞬时电转建立高表达fg12的肝癌细胞系HCCLM6细胞模型；4)用RT-PCR方法检测人高侵袭性肝癌细胞(HCCLM6)人纤维介素(hfg12),蛋白激活受体(PAR1,PAR2,PAR3,PAR4)mRNA水平的表达,在基因水平鉴定龟12的高表达与PARs表达水平的关系；5)以流式细胞技术和共聚焦检测HCCLM6细胞高表达hfg12蛋白后其细胞表面PARs的表达,在蛋白水平鉴定fg12的高表达是否引起PARs表达水平的变化；6)应用流式细胞仪液态芯片-微量样本多指标流式蛋白定量(Cytometric Bead Array, CBA)技术检测HCCLM6细胞在高表达fg12后细胞下游信号传导途径的活化；7)利用PARs受体阻断后观察fg12高表达的HCCLM6细胞下游信号传导途径的活化；2. sfg12在CHB患者中免疫调节机制研究1)通过流式细胞术和免疫共聚焦技术检测慢性病毒性肝炎患者外周血PBMC中fg12的表达；2)通过磁珠分选技术分离PBMC中CD4+CD25+CD127dim/-的Tregs,并与PBMC混合培养,检测混合培养中CD8+T细胞的增殖；3)酶联免疫法(ELISA)检测混合培养中细胞因子IFN-γ的分泌水平；[实验结果]1.(1)在人肝癌组织中fg12高表达,并且与纤维蛋白沉积明显相关；(2)fg12干扰肿瘤细胞系HCCLM6细胞以及fg12高表达HCCLM6,在mRNA水平和蛋白水平成功建立；(3)PAR1和PAR3在内源性fg12刺激下基因水平和蛋白水平表达均明显上调,PAR2表达无明显区别,PAR4检测不到；(4)内源性fg12表达刺激高侵袭性肝癌细胞系HCCLM6激活MAPK (ERK, JNK, p38)途径；(5)PAR1和PAR3阻断后,可降低ERK,p38的磷酸化,但并不降低JNK的磷酸化,而恰好相反PAR2的阻断可下调JNK磷酸化。2.(1)慢性乙型肝炎患者外周血PBMC中高表达fg12,包括分泌型和跨膜型；(2)Tregs可抑制CD8+T细胞增殖和分泌炎性因子功能；(3)阻断fg12后,CD8+T细胞增殖能力和分泌炎性因子IFN-γ功能增强。[结论]1.人肝癌组织中高表达mfg12,mfg12的表达与纤维蛋白沉积具有明显相关性。mfg12通过凝血依赖和非依赖途径激活PARs后活化MAPK途径促进肝癌的生长,侵袭和血管新生。2.CHB患者外周血中Tregs通过分泌sfg12发挥对CD8+T细胞的抑制功能,并提示sfg12有可能成为评估CHB患者免疫状态的潜在预测因子。