本研究对猪卵母细胞体外成熟、孤雌激活、体外受精、供核细胞培养、体细胞核移植及胚胎培养等技术进行了实验,并对相关影响因素做了对比和分析,以此建立猪体外胚胎生产技术和体细胞核移植技术实验体系,为进一步的转基因猪的研究提供理论和技术支持。本研究包括以下主要内容:(1)在IVM培养液中添加不同的激素或激素组合、添加不同浓度比例的FSH、LH、必须和/或非必需氨基酸等,研究它们对猪卵母细胞体外成熟的影响。(2)在不同成熟培养体系中,成熟的卵母细胞经孤雌激活后的胚胎发育情况;不同的激活电压和电脉冲时长组合对猪卵母细胞孤雌激活效率和胚胎发育能力的影响;CHX对猪卵母细胞孤雌激活效率和胚胎发育能力的影响。(3)不同体外受精液、受精时间、精子上浮时间、精液供体、颗粒细胞存在与否等条件对卵母细胞体外受精效果和胚胎发育的能力的影响。(4)初生仔猪耳/尾成纤维细胞系的建立及其生物学特征研究。(5)不同组织来源的供核细胞、不同激活剂或氨基酸培养条件对猪体细胞核移植胚胎的发育能力的影响。主要研究结果如下:实验一、猪卵母细胞体外成熟条件的研究(1)不同激素或激素组合对猪卵母细胞体外成熟影响很大,研究中发现,在含激素成熟液中培养22h后,无激素培养至44h条件下,添加PMSG+hCG组的卵母细胞核成熟率85.9±2.1%,高于FSH+LH组和E2组;不添加任何激素的对照组最低只有33.8±2.2%。(2)在猪卵母细胞IVM过程中,FSH对猪卵母细胞体外核成熟率的影响较大并与其浓度有关,随着FSH浓度上升,猪卵母细胞成熟率随之上升;LH在低浓度时对猪卵母细胞体外成熟率的影响不大,当浓度达到或超过10IU时对成熟产生促进作用;两种激素具有相互协同的作用,当在成熟液中添加10IU/mL的FSH和20IU IU/mL的LH时,猪卵母细胞成熟率达到最大80.9±2.2%。(3)在猪卵母细胞IVM液中无论是添加必需氨基酸或非必需氨基酸,或同时添加它们,都能够提高猪卵母细胞体外核成熟比例。其中添加非必需氨基酸的促进作用最大,核成熟比例最高达到83.0±2.8%;添加了必需氨基酸的成熟比例为78.6±1.5%;同时添加两种氨基酸为79.9±1.1%,略低于非必需氨基酸组。不添加氨基酸组的对照组成熟率只有74.9±2.4%。实验二、猪体外成熟卵母细胞孤雌激活条件研究(1)在不同激素条件的成熟液中成熟的卵母细胞,在经孤雌激活和胚胎培养后孤雌胚胎的发育能力明显不同。无激素对照组最低,卵裂率24.4±4.3%,未获得囊胚;添加PMSG+hCG的成熟液中成熟的卵母细胞激活后,卵裂率和囊胚率最高,分别为85.2±2.4%和55.3±1.3%;(2)猪卵母细胞孤雌激活的效果与电场强度和脉冲时长之间存在直接的关系。其中,受电场强度影响最大,在较低电压范围内,增加电场强度会提高激活效率,在较高电场强度范围内则相反。本研究中电激活的最佳条件为2.0kV/cm、30 ms、1DC,卵裂率达到90.3±1.4%、囊胚率达到46.7±1.9%。(3)CHX的应用能够提高体外成熟猪卵母细胞孤雌激活效率,这种促进与CHX作用时间和作用方式有关。电激活后,在CHX中处理8h效果最好,卵裂率87.1±1.6%和囊胚率42.9±1.1%。另外,CHX预处理也会提高激活效率,其中CHX预处理15min效果最好。实验三、影响猪卵母细胞体外受精的因素研究(1)猪卵母细胞体外受精效率受多种因素影响,本研究中发现,将精子上浮处理60min,含2-3层颗粒细胞的卵丘-卵母细胞复合体在mTBM受精液中与精子共孵育6h条件下的受精效果最好,卵裂率为77.6±2.3%,囊胚率25.7±2.6%。(2)体外受精效率受提供精液的公猪个体影响很大,不同个体精液的IVF能力差异极显著。实验四、影响体细胞核移植胚胎发育能力的因素(1)仔猪耳或尾成纤维细胞在培养过程中的生物学特征无显著差异。(2)不同的激活剂对重构胚的激活和胚胎进一步的发育能力的影响很大,其中CHX的激活和促进胚胎发育的能力最强,卵裂率67.4±0.6%,囊胚率为19.6±2.1%,6-DMAP次之,CB最差,各组间差异显著。(3)不同组织来源的供核细胞对重构胚的发育能力的影响很大,其中初生仔猪耳成纤维细胞作为核供体时的重构胚发育率最高,卵裂率为65.6±3.3%,囊胚率为17.8±2.2%初生仔猪尾成纤维细胞最差,卵丘颗粒细胞供体发育率居中。(4)非必需氨基酸具有提高核移植胚胎发育率的能力,卵裂率达到68.1±3.2%,囊胚率为20.3±2.1%,而必需氨基酸的添加会导致胚胎发育能力的下降,同时添加两类氨基酸时,胚胎发育率居中。