乳铁蛋白对仔猪工作记忆的影响及ST8SiaⅡ、ST8SiaⅢ和ST8SiaⅣ的mRNA表达分析的研究

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乳铁蛋白(lactoferrin)是一种多功能蛋白质,具有广谱抗菌、抗病毒感染作用,能调节人体内铁的平衡,调节机体免疫功能,增强机体抗病能力。乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中(包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞),人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.2mg/ml,是牛乳中的10倍(牛乳中含量为0.02-0.35mg/ml),占普通母乳总蛋白的20%。在泌乳期间,乳铁蛋白含量随着泌乳时间的不同而发生变化,如人初乳中乳铁蛋白可达6-14mg/ml,成熟乳期降至1mg/ml。有研究证明,乳铁蛋白糖基化结构中含有一分子唾液酸,而唾液酸又是脑发育的必需营养素,所以我们推测乳铁蛋白可能对婴儿早期的脑发育和认知能力的形成也有重要的影响。  工作记忆(workingmemory)是指个体在执行认知任务过程中,暂时储存与加工信息的能量有限的系统,被认为是人类认知活动的核心,是学习、推理、问题解决和智力活动的重要成分。工作记忆被形容为人类的认知中枢,是当前认知心理学、认知神经科学和发展心理学中最活跃的研究领域之一。大量的研究表明:工作记忆在个体的认知行为中起了不可替代的作用,已经被看作是个体在复杂认知行为中表现差异的重要的甚至是核心的因素。  仔猪模型已经在神经科学,尤其是脑科学的研究中得到广泛应用。成年猪的全脑重量达到80-180g,和人类非常接近,而且仔猪的消化和新陈代谢系统与婴儿的都非常相似。所以仔猪模型非常适合用于研究婴儿神经和脑发育。  本实验一共进行5轮,每轮实验35天,每两轮实验之间间隔7天(2010.5.30-2011.1.10)。实验动物是3天大雄性仔猪51头(杜洛克猪×长白猪×大约克猪杂交品种),体重在1.6~2.5kg之间,购于厦门牧兴实业有限公司。然后根据奶粉中乳铁蛋白不同的含量[0.32mg/g(对照组),3.2mg/g(中剂量组),6.3mg/g(高剂量组)]将仔猪分成3组饲养,目的是研究不同剂量乳铁蛋白对仔猪工作记忆的影响。每轮实验选取两头3天大的仔猪麻醉处死,取前额叶、海马、心、肝、脾、肾、胰腺、肌肉等组织器官作为发育实验的对照组,并从海马组织中提取总RNA,用于克隆猪ST8SiaⅡ的编码区序列。每天记录仔猪的体重并且在3天、17天、28天和39天大时分别采静脉血用于应激激素(cortisol和促肾上腺皮质激素)检测分析。在仔猪37天开始进行工作记忆行为学实验。第一天每个仔猪被单独测试8轮,第2天即在日龄38天每个仔猪被单独测试2轮。根据人与猪的寿命比,此时仔猪日龄相当于人类婴儿9个月。39天日龄时,麻醉处死仔猪,取前额叶、海马、心、肝、脾、肾、胰腺、肌肉等组织器官,进行荧光定量PCR分析,检测ST8SiaⅡ、ST8SiaⅢ和ST8SiaⅣ等与脑发育和唾液酸和多聚唾液酸代谢相关目的基因mRNA表达量变化。  本研究结果显示:1.猪ST8SiaⅡ编码区克隆结果显示:猪ST8SiaⅡ的氨基酸序列与人类ST8SiaⅡ氨基酸序列的同源性达到98%,在374个氨基酸中只有7个不同。另外,ST8SiaⅡ、ST8SiaⅢ和ST8SiaⅣ的mRNA在发育过程中在前额叶、海马、心、肝、脾、肾、胰腺、肌肉等组织器官中表达的组织特异性分析结果,为以后进一步的研究多聚唾液酸的合成和代谢提供了重要的基础数据。2.三种不同剂量组的动物在工作记忆行为试验中的表现差异没有统计学意义。但是我们发现在短时定位记忆(5分钟)和长时定位记忆(30分钟、16小时)方面,中、高剂量组的仔猪表现要好于对照组,且在长时定位记忆(30分钟)中,高剂量组和对照组的表现差异具有统计学意义(P值为0.046)。3.通过荧光定量PCR分析结果显示,高剂量组海马组织中的ST8SiaⅡ、ST8SiaⅢ和ST8SiaⅣ基因mRNA的表达量要高于对照组(P值分别为0.016、0.047、0.014)。  本研究结果可得出以下结论:1.饮食中添加乳铁蛋白对改善短时记忆和长时记忆有一定的促进作用。2.乳铁蛋白的摄入会促进海马中与多聚唾液酸合成及代谢相关基因(ST8SiaⅡ、ST8SiaⅢ和ST8SiaⅣ)mRNA的表达。此结果为乳铁蛋白改善短时记忆和长时记忆作用的重要机制。3.猪ST8SiaⅡ与人类ST8SiaⅡ的氨基酸同源性达到98%。
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