酿酒酵母（S.cerevisiae）不仅作为真核模式生物广泛用于遗传、生化等基础研究,也是酒精类饮品和乙醇燃料的主要生产菌株。发酵生产的菌株虽然具有良好的乙醇耐受性,但持续增加的乙醇浓度也会抑制细胞生长和活力,成为提高发酵产能的重要限制因素。目前酵母对乙醇胁迫的耐受机理尚不完全明晰,为进一步深入了解相关机制,本论文开展以下探究:首先,我们检测了乙醇胁迫对野生型BY4741菌株细胞毒性,结果显示随着处理浓度的升高对酵母细胞生长和分裂的抑制程度而增加,同时高浓度乙醇诱导的TBARS积累远高于对照组;PI染色检测细胞膜的完整性,显示乙醇胁迫膜的完整性受损,细胞死亡数显著高于对照组。文献报道活性氧是发酵过程中乙醇胁迫细胞的重要因素。我们使用荧光探针DCFH-Da检测细胞内ROS水平,发现乙醇胁迫下细胞内活性氧水平略有升高,与对照组并无显著性差异,外源抗氧化剂Vc也不能阻断乙醇诱导的细胞毒性,可以推断活性氧并非乙醇胁迫细胞的主要因素。检测氧化应激相关基因缺失菌株的乙醇胁迫敏感表型,发现YAP1缺失后对2 m M H2O2具有高度敏感性而对10%乙醇不敏感,再一次表明,活性氧不是介导乙醇抑制细胞生长的主要原因。乙醇胁迫与细胞自噬存在关联。我们的实验结果显示自噬关键基因ATG9突变对乙醇胁迫有耐受表型,进一步检测乙醇胁迫下ATG8基因m RNA和蛋白质细胞表达水平均显著提高,抗氧化剂Vc也不能明显减弱自噬强度,证明自噬在乙醇抑制酵母细胞生长中发挥重要调控作用。随后,我们检测了自噬缺陷atg1（?）、atg9（?）、atg10（?）在乙醇胁迫下的生长状况,发现ATG突变具有明显的乙醇抗性;同时添加自噬诱导剂雷帕霉素Rap明显抑制ATG突变菌株生长优势,但同时添加TOR的激活剂KIC（4-甲基-2-氧戊酸）并没有像预期的那样明显提高野生型BY4741菌株对10%乙醇的耐受性,降低突变体的相对生长优势。TORC是细胞营养代谢的中心调控分子,对细胞内碳、氮代谢及自噬具有重要调控作用。乙醇是葡萄糖代谢的中间产物,因此推测TORC介导的葡萄糖代谢途径参与了ATG突变株乙醇抵抗作用。于是我们分别用半乳糖、甘油和乙醇替代培养基中的葡萄糖,检测ATG缺陷菌株在乙醇胁迫下的遗传活性,发现自噬缺陷菌株在半乳糖、甘油为碳源培养基中与含2%葡萄糖培养基相似表现生长优势,但在乙醇为碳源培养基中无生长优势。由于半乳糖和甘油的代谢利用经过了糖酵解途径,而乙醇则不经过糖酵解途径,推测ATG缺陷菌株耐受乙醇与糖酵解过程有关。在乙醇胁迫培养基中添加2-脱氧葡萄糖（2-DG）和柠檬酸钠来抑制糖酵解途径,发现提高了野生型BY4741菌株的乙醇耐受,同时ATG突变atg1（?）、atg9（?）、atg10（?）失去了生长优势。可以得出结论自噬缺陷菌株对乙醇的耐受在一定限度内依赖于糖酵解途径的完整性,并推测编码糖酵解途径关键酶基因（tdh1（?）、tdh2（?）、tdh3（?）、pfk1（?）和hxk2（?））缺失在乙醇胁迫下将表现出较野生型菌株的生长优势。检测结果印证了从遗传通路上中断糖酵解过程可以提高突变细胞的乙醇耐受。但是在添加丙酮酸钠激活三羧酸（TCA）循环,并不能改变菌株对乙醇的生长抑制,所以自噬缺陷菌株耐受乙醇过程不依赖于TCA循环。同时检测pfk1（?）的自噬强度也显示,抑制糖酵解途径后,细胞内维持较低的自噬水平,从而更有利于酿酒酵母细胞耐受乙醇。在atg9（?）的基础上敲除PFK1,构建出atg9（?）/pfk1（?）双缺失突变体,发现atg9（?）缺陷菌株的生长优势被消除。再次证明,ATG突变中断了糖酵解途径诱导的自噬,从而提高了酿酒酵母的乙醇耐受。综上所述,乙醇胁迫能对酵母细胞产生氧化损伤,但并不是其发挥抑制作用的主导因素;过度激活自噬能抑制酵母在乙醇胁迫下的生长,ATG突变能中断糖酵解途径诱导的自噬过程提高酿酒酵母的乙醇耐受。本研究拓展了对乙醇胁迫的细胞耐受机理的认识,也为提高乙醇发酵产能提供新的解决思路。