内皮细胞位于血管内侧,在血液和组织之间起着屏障作用。物理或化学因素的刺激下,能使内皮细胞合成和分泌一系列效应分子,如一氧化氮(nitirc oxide,NO)、内皮素(endothelin-1,ET-1)、前列环素(prostacyclin,PGI2)和血栓素(thromboxane A2,TXA2)等,通过调节血管张力、血细胞迁移、内环境稳态平衡、细胞增殖、血栓形成及炎性反应等作用调节机体的功能。内皮细胞功能紊乱与多种心血管疾病密切相关。一方面,很多心血管疾病能够诱发内皮功能紊乱,导致内皮细胞调节和分泌功能失衡;另一方面,内皮功能紊乱能够促进心血管疾病及其并发症的病理进程和发展。大量的临床研究表明,高血压、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、糖尿病及肺动脉高压等多种疾病的发病机制及发生发展涉及到内皮功能紊乱。内皮细胞功能紊乱主要表现为NO的生物利用度降低。以高血压为例,高血压病人内皮功能紊乱表现为氧化应激产物增加和血管炎症引起的继发性NO生物利用度降低。高血压大鼠的血管对于剪切力或乙酰胆碱诱导的舒张反应减弱,提示高血压大鼠的血管内皮细胞功能受损,NO的合成和释放能力或生物利用度降低,同时,功能紊乱的内皮细胞在一些化学和物理因素刺激下能够增加ET-1、血管紧张素(angiotensin,Ang)、PGE2、PGD2和超氧阴离子等内皮源性缩血管物质的合成和分泌。另外,内皮功能紊乱是动脉粥样硬化发生的早期标志,心血管事件发生的危险因素,充血性心力衰竭病人内皮功能紊乱促使冠状动脉受损,运动能力下降。因此,在治疗高血压、心力衰竭等心血管疾病的同时,给予内皮细胞以保护,纠正内皮功能紊乱,对于疾病的治疗、预后及预防心血管事件的发生具有十分重要的意义。埃他卡林(iptakalim,Ipt)为一种ATP敏感性钾通道开放剂(ATP-sensitive potassium channel opener,KCO),是我国学者自主研发的、具有完全自主知识产权的1.1类高血压创新药物,目前已完成抗高血压Ⅲ期临床试验。本实验室前期对埃他卡林的研究发现,它具有完全不同的新化学结构和新的药理学作用特征:一方面,在分子结构上,埃他卡林属于脂肪胺类新化学结构类型,不同于以往报道的八种结构类型的KCOs;另一方面,埃他卡林对SUR2B/Kir6.1亚型的ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)具有选择性激活作用。对SUR2B/Kir6.1通道的选择性激活作用是其靶向扩张阻力血管,产生强效抗高血压作用以及降低不良反应的药理学基础。此外,体外研究证明,埃他卡林通过开放内皮细胞katp通道能够纠正高尿酸、高葡萄糖、高同型半胱氨酸及高低密度脂蛋白导致的内皮功能紊乱,其机制可能是通过增加内皮细胞释放no,降低et-1的分泌,以及降低单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1,mcp-1)、细胞间黏附分子-1(intercellularadhesivemolecule-1,icam-1)和血管细胞黏附因子-1(vascularcelladhesivemolecule-1,vcam-1)的表达。体内研究也表明,埃他卡林开放katp通道,通过保护内皮细胞功能治疗高血压伴发的胰岛素抵抗,保护高尿酸导致的高血压合并肾脏损伤,逆转压力超负荷诱导的心肌肥大以及心力衰竭,通过保护神经血管单元(包括大脑中动脉微血管内皮、星形细胞和神经元)对抗缺血-再灌注造成的脑损伤。埃他卡琳的衍生物纳他卡林(natakalim,nat)也表现出对sur2b/kir6.1通道良好的选择性以及有效的内皮保护作用。本论文在本实验室前期研究的基础上,进一步的探究埃他卡林和纳他卡林对katp通道的亚型选择性以及内皮细胞保护效应的具体分子途径。研究的重点主要包括两个通道,即sur2b/kir6.1型katp通道和ca2+渗透的瞬时受体电位通道香草醛亚型-1(transientreceptorpotentialvanilloidtype-1,trpv1)通道在埃他卡林和纳他卡林内皮保护效应中的作用。第一部分,埃他卡林和纳他卡林对katp通道亚型选择性的研究本研究中设计并应用特异性的小干扰rna(smallinterferencerna,sirna)分别降解脐静脉内皮细胞系ea.hy926细胞上表达的katp通道各亚基mrna,降低各亚基蛋白的表达,以建立各亚基有效的rna干扰(rnainterference,rnai)模型,然后分别孵育不同浓度的kcos,包括埃他卡林、纳他卡林、吡那地尔和二氮嗪,同时,设置正常细胞组给予相同的药物及剂量处理,以内皮保护效应分子no为检测指标,比较相同药物剂量的rnai组和正常细胞组上清液中no的含量。研究结果显示,在正常内皮细胞中,埃他卡林和纳他卡林10μmol/l显著地促进no的释放,吡那地尔和二氮嗪促进内皮细胞释放no的作用相对较弱,在1mmol/l浓度时才能显著性地增加内皮细胞释放的no量。在内皮细胞sur2b亚基沉默后,埃他卡林、纳他卡林、吡那地尔和二氮嗪促进内皮细胞释放no的作用均出现显著地减弱;sur2a亚基沉默后,埃他卡林、纳他卡林、二氮嗪促进内皮细胞释放no的作用没有出现明显的改变,而吡那地尔促进内皮细胞释放no的量出现明显的降低;kir6.1亚基沉默后,埃他卡林、纳他卡林、吡那地尔和二氮嗪促进内皮细胞释放no的作用均出现显著地减弱;kir6.2亚基沉默后,埃他卡林、纳他卡林、二氮嗪促进内皮细胞释放no的作用没有出现明显的改变,而吡那地尔促进内皮细胞释放no的量显著降低。提示,埃他卡林和纳他卡林促进内皮细胞释放no的作用需要sur2b和kir6.1亚基的共同存在,即可选择性的激活内皮细胞sur2b/kir6.1通道,二氮嗪的作用与两者相似,对内皮细胞sur2b/kir6.1亚型具有选择性;而吡那地尔对内皮细胞上各个katp通道亚型作用无选择性。第二部分,埃他卡林和纳他卡林对内皮细胞钙离子信号通路的影响对埃他卡林和纳他卡林扩张血管作用的研究发现,两者均能剂量依赖性地扩张阻力血管,且它们的扩张作用具有内皮依赖性的特点。它们内皮依赖性地扩血管效应可能与升高内皮细胞胞内钙离子浓度(intracellularcalciumconcentration,[ca2+]i),促进内皮源性的舒张因子(endothelium-derivedrelaxingfactor,edrf)和内皮源性的超极化因子(endotheliumderivedhyperpolarizingfactor,edhf)释放相关。内皮细胞属于非兴奋性细胞,且缺乏电压依赖性的钙离子通道(voltagedependentcalciumchannel,vdcc),其对ca2+的渗透作用受膜电位的调节,在细胞膜超级化状态下,细胞内、外的电化学梯度差增大,驱动胞外的ca2+内流进入细胞内。kcos超极化内皮细胞膜诱导的胞外ca2+内流在早期就有多项研究报道,但是对于kcos诱导胞外ca2+内流进入细胞内的具体分子通道尚缺乏相关研究。经过前期的文献调研及筛选,本研究中选取trp通道家族中介导内皮依赖性扩血管作用的trpv1和trpv4通道作为初步的研究对象。在离体的肠系膜三级微动脉血管环上,孵育trpv4通道阻断剂rn1734,埃他卡林和纳他卡林的扩张作用未出现明显的改变,但是,对于孵育trpv1通道阻断剂sb366791或capsazepine的血管,埃他卡林和纳他卡林的扩张作用受到显著地抑制,提示,埃他卡林和纳他卡林内皮依赖性扩血管作用可能是通过开放内皮细胞trpv1通道实现的。在血管内皮细胞上,应用激光共聚焦技术实时地监测胞内的ca2+浓度,并检测药物对细胞的影响。结果显示,埃他卡林和纳他卡林1、10和100μmol/l能够剂量依赖性地引起内皮细胞[ca2+]i快速而短暂的升高,它们的升高作用能够被trpv1通道阻断剂sb366791或capsazepine剂量依赖性地拮抗,提示埃他卡林和纳他卡林通过开放内皮细胞trpv1通道使细胞外的ca2+内流进入细胞内。通过应用rnai技术沉默内皮细胞上表达的trpv1通道,进一步验证trpv1通道在埃他卡林和纳他卡林ca2+内流作用的影响,结果显示,trpv1通道蛋白表达降低后,埃他卡林和纳他卡林的作用均出现显著的减弱。此外,katp通道阻断剂格列苯脲(glibenclamide,gli)也能够有效地拮抗埃他卡林和纳他卡林升高[ca2+]i的作用,提示,埃他卡林和纳他卡林开放内皮细胞trpv1通道促进细胞外ca2+内流作用受katp通道的调节。第三部分,埃他卡林和纳他卡林的内皮保护效应研究本实验室前期的研究发现,开放内皮细胞katp通道具有内皮保护效应,可纠正心血管独立危险因素,如高糖、高尿酸、高同型半胱氨酸和高低密度脂蛋白诱发的内皮功能紊乱。其作用与升高内皮细胞[ca2+]i浓度,增加no的释放,降低et-1的分泌相关。内皮细胞分泌的no具有调节血管张力、抗血小板凝聚及血栓形成,抗平滑肌增殖及血管纤维化、抗炎等效应,其生物利用度降低是内皮功能紊乱的重要特征。本论文的研究发现,埃他卡林和纳他卡林具有促进内皮细胞释放no的作用,此作用能够被10μmol/lkatp通道拮抗剂格列苯脲阻断。埃他卡林和纳他卡林引起ca2+内流的trpv1通道在被sb366791阻断后,两者促进内皮细胞释放no的作用也出现显著的减弱,提示no释放的增加与提高内皮细胞[ca2+]i相关。1mmol/l的同型半胱氨酸能诱导内皮细胞功能紊乱及死亡,预孵育埃他卡林或者纳他卡林能逆转其诱导的细胞活力降低,但是,格列苯脲和sb366791均能够显著地拮抗埃他卡林和纳他卡林的内皮保护效应。结合前期埃他卡林和纳他卡林对内皮sur2b/kir6.1亚型的选择性,提示sur2b/kir6.1通道和trpv1通道是埃他卡林和纳他卡林产生内皮保护效应的重要分子通道。综合所述,本论文的研究结论如下:1.本研究应用rnai的方法,成功降低了ea.hy926细胞上鉴定出的四个katp亚基sur2b、sur2a、kir6.1和kir6.2的表达,证明了埃他卡林和纳他卡林对内皮细胞sur2b/kir6.1亚型具有高选择性,它们促进内皮细胞释放no的作用是通过选择性激活sur2b/kir6.1通道实现的;2.本研究发现了kcos引起内皮细胞ca2+内流的关键通道,即trpv1通道。埃他卡林和纳他卡林靶向激活内皮细胞sur2b/kir6.1型katp通道,导致k+外流,细胞膜超极化,膜内、外的电化学梯度差增加,驱动细胞外的ca2+通过trpv1通道进入细胞内,增加细胞内ca2+浓度,ca2+与钙调蛋白结合,改变enos的磷酸化状态,增强enos的活性,增加no的合成和分泌,同时,[ca2+]i的升高可开放钙离子激活的钾通道(ca2+-activatedk+(kca)channel),包括小电导钙离子激活钾通道(small-conductancekca,skca)和中电导钙离子激活钾通道(intermediated-conductancekca,ikca),引起k+的进一步外流,以edhf形式和edrf共同参与了埃他卡林和纳他卡林内皮依赖性扩张阻力血管的作用。3.本研究证明了trpv1通道参与埃他卡林和纳他卡林对内皮细胞的保护效应。TPRV1通道阻断后,埃他卡林和纳他卡林引起的胞外Ca2+内流减少,促进NO释放的作用减弱,同时,两药逆转同型半胱氨酸诱导的内皮活力降低作用受到抑制。