松果体细胞带有突起,含有分泌颗粒;而且,支配松果体的神经纤维,也可以释放神经肽;因此,松果体内肽类物质,是位于松果体细胞,还是位于支配松果体的神经纤维,目前仍不十分确切。人们普遍认为,肽类激素分泌颗粒,是以胞吐分泌的方式释放;但也有学者认为,肽类激素分泌颗粒的释放形式,可能存在连同颗粒被膜的整体释放。由于松果体的毛细血管为窗孔型,相对缺乏血脑屏障,故多数学者认为,松果体细胞释放的分泌物,立即进入血液循环;也有学者认为,松果体分泌的褪黑素,可以直接释放到第三脑室或蛛网膜下隙的脑脊液中。对人和牛等的血液和脑脊液中,褪黑素浓度的分析表明,脑脊液中浓度通常高于血液数倍;所以,褪黑素有可能被直接释放入脑脊液,从而最快最有效地到达脑内的作用靶点。本研究课题,旨在探讨松果体肽类激素的化学性质和释放形式,观察松果体分泌物直接释放到蛛网膜下隙脑脊液途径的结构基础;为进一步阐明松果体的功能,也为临床相关疾病的诊治,提供形态学依据。一、大鼠松果体细胞原代培养体系的建立目的:建立体外培养的大鼠松果体细胞系,观察培养的松果体细胞在生长、增殖和功能状态等生物学方面的变化,探讨培养松果体细胞的最佳生长和功能状态时机,为摆脱神经及体液等因素对松果体的影响、揭示松果体细胞自身合成和分泌肽类激素,提供实验研究依据。方法:于春季上午9:00~10:00,将颈椎脱臼法处死的生后1~3天SD乳鼠,经75%乙醇消毒后,将颅骨骨片向前掀起,游离粘连于颅骨上的松果体浅部,剥除脑膜及血管;将松果体剪碎,离心后加入0.125%胰酶和0.02%EDTA混合消化液,37℃消化15min;加入含10%新生牛血清、青霉素100IU/ml和链霉素100IU/ml的DMEM/F12培养液,终止胰酶消化,制备成单细胞悬液;接种于放有盖玻片的六孔板中,置于37℃含5%CO2饱和湿度的培养箱内,在上述混合培养基中培养;分别在接种后的第3、7、10、13天,半量更换混合培养基。每天定时在倒置显微镜下观察其生长情况;取培养第12天的细胞爬片,行免疫细胞化学染色,4%多聚甲醛固定1h,1%TritonX-100室温30min,一抗为兔抗人多克隆5-HT抗体工作液,4℃过夜;二抗为生物素标记的羊抗兔IgG工作液;应用辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液、DAB显色;采用0.125%胰酶和0.02%EDTA混合消化液消化法,取培养到第15天的细胞,2 %多聚甲醛和2.5 %戊二醛混合固定液,4℃固定3h,进行常规TEM样品的制备与观察;取培养第15天的细胞爬片,1%戊二醛4℃固定1h,梯度乙醇脱水,自然干燥后镀金,SEM观察。结果:在倒置显微镜下观察显示,在接种6h后,培养细胞贴壁;接种后的4天内,贴壁细胞增殖缓慢;接种后第5~6天,细胞增殖加快;在接种后的第7~8天,出现典型的培养细胞巢,为较暗的圆形、椭圆形、三角形或多角形的松果体细胞;在成纤维样细胞层的上方中央,呈铺路卵石样密集排列;第8~12天,细胞增殖旺盛,形成许多面积大小不一、细胞数量不等的细胞巢;在第12~15天,分散的、呈片状的成纤维样细胞层逐渐融合,其上的细胞巢内呈铺路卵石样排列的细胞逐渐分散,细胞巢变得不典型。在细胞巢的周边和细胞巢的空穴内,可见少量胞体较大、突起粗大的多边形神经胶质样细胞。在培养第12天的细胞爬片上,可见5-HT免疫反应阳性细胞,外观似双极神经元。TEM观察显示,体外培养15天的松果体细胞内,有丰富的粗面内质网和游离核糖体、密集的线粒体、少量直径300nm左右的膜包密芯分泌颗粒;在细胞质内,还可见到许多大小不等的囊泡。在体外培养15天的细胞爬片上,SEM观察显示,可见梭形和近似球形的松果体细胞。结论:实验建立了大鼠松果体细胞体外培养体系,方法简单易行、价格低廉。在培养的第7~8天,出现典型的细胞巢,为较暗的圆形、椭圆形、三角形或多角形松果体细胞,位于成纤维样细胞层的上方中央,呈铺路卵石样密集排列。培养10～15天时,细胞生长状况较好,是进行免疫细胞化学研究,或做透射电镜观察的最佳时机。二、大鼠松果体内生长抑素免疫反应阳性细胞和纤维的观察目的:由于松果体细胞带有突起,又含有分泌颗粒;而且,支配松果体的神经纤维,也可以释放神经肽。然而,松果体内的肽类物质,是位于松果体细胞内,还是位于支配松果体的神经纤维内,目前仍不十分清楚。为此,本文旨在探讨松果体细胞,是否自身能够合成与分泌生长抑素样抑制性激素。方法:1松果体内生长抑素的免疫细胞化学观察取15天龄SD大鼠,于春季上午9 : 00～11 :00,腹腔注射20 %乌拉坦麻醉下,左心室插管快速灌流0.9%温生理盐水,再用4℃的4%多聚甲醛灌注约1h,断头取松果体浅部,置于4℃的4%多聚甲醛中72h;冰冻切片,片厚14μm;1%TritonX-100室温30min,一抗为兔抗人多克隆生长抑素抗体工作液,4℃反应68h,二抗为生物素标记的羊抗兔IgG工作液;辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液和DAB显色。2生长抑素在培养大鼠松果体细胞的表达取新生SD大鼠松果体,进行松果体细胞培养;取培养第12天的细胞爬片,4%多聚甲醛中固定1h,1%TritonX-100室温30min,一抗为兔抗人多克隆生长抑素抗体工作液,4℃反应36 h,二抗为生物素标记的羊抗兔IgG工作液;辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液和DAB显色。3松果体内生长抑素的免疫金电镜观察取新生SD大鼠,于春季上午9 : 00～11 :00,断头,取松果体浅部,4℃的3 %多聚甲醛和1 %戊二醛中固定60min,4℃的4 %多聚甲醛中再固定2h;然后进行常规TEM样品包埋,超薄切片载于镊网上;一抗为兔抗人多克隆生长抑素杭体工作液,4℃反应70h;胶体金(15nm)标记羊抗兔IgG稀释液(1:10),37℃反应60min;醋酸铀和枸橼酸铅染色,透射电镜观察。结果:1松果体内生长抑素的免疫细胞化学观察在15天龄的大鼠松果体,可见数量稀少的生长抑素免疫反应阳性细胞,其外观呈椭圆形或三角形,胞体直径大于其它背景染色细胞;其中有些阳性细胞,发出1~2条细长、生长抑素免疫反应阳性突起,走行于松果体实质细胞之间。在松果体实质细胞之间,偶尔可以见到结节状膨大的、生长抑素免疫反应阳性纤维。2生长抑素在培养大鼠松果体细胞的表达在体外培养第12天的细胞爬片上,可以见到生长抑素免疫反应阳性细胞;其胞体外观呈圆形、椭圆形、三角形或梭形,从胞体上发出2~3条细长的、生长抑素免疫反应阳性的突起。3松果体内生长抑素的免疫金电镜观察在生后1天的大鼠,松果体的实质细胞,主要由松果体细胞构成;其中,只有少量松果体细胞,含有大型致密核芯分泌颗粒,这些分泌颗粒的数量较少,在细胞质内呈散在分布或数个成堆分布。在应用树酯包埋后染色、免疫金电镜技术所做的超薄切片上,可在某些松果体细胞的胞浆内,观察到散在分布的或聚集成堆的标记金颗粒。结论:在大鼠松果体内,存在生长抑素免疫反应阳性细胞和纤维。少量松果体细胞内,含有大型致密核芯分泌颗粒。少量松果体细胞的胞质内,含有生长抑素免疫反应阳性物质。有些体外培养的松果体细胞,可以合成和分泌生长抑素。三、大鼠松果体分泌物释放入蛛网膜下隙脑脊液途径的结构基础目的:哺乳动物的松果体,富含窗孔型毛细血管,相对缺乏血脑屏障。因此,多数学者认为,松果体细胞释放的分泌物,立即进入血管并经血液循环运输。由于人蛛网膜下隙脑脊液中的褪黑素浓度,显著高于血液中浓度;因此,松果体分泌物有可能通过脑脊液,直接到达脑内的作用靶点。多数学者认为,多肽激素的分泌颗粒,是以胞吐分泌的方式释放,但是也有学者认为,可能存在连同颗粒被膜的整体释放。为此,本文对大鼠松果体的细微和超微结构特点进行观察,为松果体细胞分泌颗粒的释放形式和转运途径,以及与蛛网膜下隙脑脊液的关系,提供形态学证据。方法:于春季上午9:00～11:00,SD大鼠在腹腔注射20%乌拉坦麻醉下,直接断头取松果体浅部,12月龄大鼠的松果体,置于4℃的3 %多聚甲醛和1 %戊二醛溶液中,浸泡固定48 h,然后进行常规TEM样品的制备与观察;1.5月龄和12月龄的大鼠松果体,置于4℃的2 %多聚甲醛和2.5 %戊二醛混合固定液中,浸泡固定48h,然后进行松果体囊表面的常规SEM样品制备与观察;同时,12月龄大鼠在乌拉坦麻醉下,经左心室插管,快速灌注0.9%温生理盐水冲洗后,断头取松果体浅部,移入1%锇酸4℃固定1h,然后进行DMSO冷冻割断法的SEM样品制备及观察。结果:1 TEM观察TEM观察显示,大鼠松果体毛细血管为窗孔型(孔径50nm),借基膜与宽阔的血管周隙分隔;松果体细胞与结缔组织之间,也有基膜相互分隔,相邻的松果体细胞则紧密相贴。在松果体细胞的连接面之间,局部细胞膜凹陷,形成大量管径不等的细胞间小管;其管腔面比较光滑,无基膜覆盖,有些小管内可见到膜壳和膜碎片样结构。但是,在构成细胞间小管的松果体细胞之间,未观察到紧密连接。松果体细胞间小管,与松果体内结缔组织间隙和血管周隙互相连通。松果体囊与软脑膜相延续,由扁平的囊上皮细胞和上皮下结缔组织构成;在上皮下结缔组织间隙内,可见松果体细胞的胞体及突起等结构。松果体囊扁平上皮细胞的排列,呈现两种不同的形式:一种是囊上皮细胞的扁平叶瓣,排列成叠瓦状,形成瓣膜样连接,平行的囊上皮叶瓣之间,宽处可达1μm;另一种是囊上皮细胞排列成单层,有些相邻的囊上皮细胞,其游离缘之间相互分离,形成直径约2.5μm的囊上皮孔。2 DMSO冷冻割断法SEM观察SEM观察显示,在大鼠松果体的割断面上,相邻的松果体细胞膜相对面凹陷,形成许多细胞间小管,宽阔的血管周(围结缔组织间)隙清晰可辨,细胞间小管与血管周隙相互交通。3 SEM观察松果体囊表面SEM观察显示,囊上皮细胞之间存在筛状和喇叭口状上皮孔。筛状上皮孔主要存在于1.5月龄大鼠的松果体囊,是由上皮细胞周边部的胞质突起,相互交织形成的圆形孔洞,直径约200~500nm;喇叭口状上皮孔见于1.5月龄和12月龄大鼠的松果体囊,是由相邻上皮细胞向松果体内部凹陷,形成圆形或椭圆形孔洞,孔径约1~4μm。在大鼠松果体囊表面,还可见到直径0.5~1μm的球形颗粒、膜壳和胞膜碎片,偶见圆形和多突起的巨噬样细胞。结论:松果体细胞表面,可分为结缔组织间隙面、连接面和细胞间小管面三个功能面;相临的松果体细胞之间,局部细胞膜凹陷,形成互相连通的细胞间小管。大鼠松果体细胞分泌颗粒的释放形式,可能存在连同颗粒被膜的整体释放。松果体分泌物可通过结缔组织间隙面,释放入血管周隙;或通过细胞间小管面,释放入细胞间小管内。释放到松果体组织液中的分泌颗粒,可能通过血管周隙—细胞间小管—松果体囊结缔组织间隙—囊上皮瓣膜样连接或囊上皮孔,直接进入蛛网膜下隙的脑脊液中。由于渗透压等理化性质的改变,分泌颗粒膨胀,部分颗粒被膜破裂,释放出松果体激素微粒,随脑脊液转运和发挥作用。