为建立一套简便、有效的转基因水牛制作技术方法,本研究对水牛显微受精介导转基因和受精卵胞质内注射转基因的相关影响因素进行了系统研究。　　 1.探讨了应用ICSI-Tr(intracytoplasmic sperm injection-mediated transgenesis)技术生产转基因水牛胚胎的可行性。以p18T-BCN5.2-IFN-1.1pA-EGFP为载体,比较了精子的不同处理方式(NaOH和冻融)、NaOH处理精子不同时间(5min、10min、20min、30min和60min)以及不同外源DNA浓度(5ng/μL、10ng/μL、25ng/μL和50ng/μL)对ICSI-Tr转基因效率的影响。结果显示:NaOH处理组的囊胚EGFP表达率46.1％,与冻融精子处理组(47.1％)差异不显著,但发育率显著高于冻融处理精子组(28.3％vs16.7％,P＜0.05)。处理60 min和30min组的分裂率为78.9％和77.5％,显著高于20min、10min和5min组的64.0％、60.0％和64.0％(P＜0.05),其中30min处理组的囊胚EGFP表达率高达44.4％,显著高于其他处理组(P＜0.05)。25ng/μL组和50ng/μL组的早期胚胎EGFP表达效率差异不显著(41.3％vs42.5％),但显著高于5ng/μL和10ng/μL组(22.5％和35.5％),25ng/μL组的囊胚EGFP表达效率显著高于其他组(P＜0.05)。　　 2.探讨了受精卵胞质内注射生产转基因水牛胚胎的可行性。通过比较了受精后注射外源DNA的时间(6h、7-8h、9-10h、11-12h、13-16h和18-20h)、外源DNA的浓度(10ng/μL、25ng/μL、50ng/μL和70ng/μL)和DNA不同的线性和环状比例(4:1、3:1、2:1、1:1、0:1和1:0)的转基因效率发现,7-8h和9-10h注射组的囊胚EGFP表达率分别为50.0％和42.9％,显著高于其他组(P＜0.05)。50ng/μL和70ng/μL组的囊胚EGFP表达率为50.0％和66.7％,显著高于其他处理组(P＜0.05),随着DNA浓度的升高,囊胚期的EGFP表达效率呈逐渐升高趋势,但囊胚率逐渐降低,适宜的注射浓度为50ng/μL。外源DINA线性环状比4:1和1:0组的囊胚EGFP表达率为50.0％和40.0％,显著的高于其他比例组(P＜0.05)。　　 上述结果表明:应用ICSI-Tr技术生产转基因水牛胚胎,NaOH处理精子适宜的时间为30min,适宜的p18T-BCN5.2-IFN-1.1pA-EGFP载体DNA浓度为25ng/μL。应用受精卵胞质内注射生产转基因水牛胚胎,适宜的注射时间为IVF后7-10h;适宜的载体DNA浓度为50ng/μL;适当比例(4:1)的线性和环状DNA,有助于提高受精卵胞质注射胚胎的转基因效率。