论文部分内容阅读
[目的]腰背痛已经成为全世界范围内最常见的肌肉骨骼疾病之一,具有发病率高、治疗难度大、远期治疗效果欠佳的特点。研究显示许多因素都可以导致腰背部疼痛,椎间盘退行性改变(intervertebral disk degeneration,IDD)被认为是其中最重要的因素之一。IDD是一个由细胞介导的异常反应,包括:1.髓核(nucleus pulposus,NP)部分基质成分合成减少;2.基质金属蛋白酶含量的增加;3.NP细胞的凋亡及死亡。研究表明非编码RNA (non-coding RNA,ncRNA)广泛存在于生命体当中,而且可以通过调节基因的表达在许多生物学过程中发挥重要的作用。环状RNA (cicular RNA,circRNA)是近来新发现的一类ncRNA,可通过吸附微小RNA (microRNA,miRNA)在细胞质中作为miRNA海绵,发挥竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)的作用,起到促进miRNA靶基因表达的作用。现已证实RNA调控网络的异常在多种疾病的发生、发展过程中都起到重要作用。然而,目前circRNA在IDD过程中的调控作用及相关机制尚缺乏报道。本实验旨在利用生物信息学方法寻找IDD过程中起关键调控作用的circRNA,并探索其在IDD过程中的调控机制。[方法]1.通过HE染色方法观察退变的NP组织的形态学改变。2.通过TUNEL荧光染色观察退变的NP组织中NP细胞的凋亡情况。3.从GEO数据库下载的正常NP组织和退变的NP组织中circRNA和microRNA芯片数据并进行差异表达分析,寻找关键circRNA以及与其表达呈负性相关的microRNA。4.通过荧光原位杂交的方法检测关键circRNA和与其存在显著负相关的microRNA在NP细胞内定位。5.采用荧光素酶报告基因实验检测关键circRNA和microRNA的结合位点。6.随后利用 miRPathDBv1.O、DIANA-miRPathv3.0、TargetScan数据库预测关键microRNA调控的通路,同时利用DIANA,miRTarBase,TargetScan,miRDB数据库预测该microRNA靶基因。7.在NP细胞内分别过表达关键circRNA和关键microRNA,利用Western blotting和RT-PCR检测靶基因的表达情况。8.通过流式细胞仪检测关键circRNA对NP细胞凋亡的影响。[结果]本研究通过检索GEO数据库中关于IDD的circRNA芯片数据,构建circRNA在退变的椎间盘NP细胞中的表达谱,随后通过生物信息学方法筛选出104条差异表达的circRNA,并且预测出343个microRNA应答元件。近一步结合样本来源相同的miRNA芯片数据及相关性分析,预测出circ-GRB1O和miR-328-5p的相互调控关系。通过原位杂交实验验证了 circ-GRB10和miR-328-5p在NP细胞质中存在共定位关系,并且观察到circ-GRB10和miR-328-5p在NP细胞中表达量的变化,近一步证实了芯片分析的结果。在circ-GRB1O的生物功能学验证的实验部分,本研究通过荧光素酶报告基因实验证实了 circ-GRB10作为miR-328-5p海绵的作用,并且确定了 circ-GRB10和 miR-328-5p 的相互作用位点。通过 miRPathDBv1.O、DIANA-miRPathv3.0、TargetScan数据库预测miR-328-5p的调控通路,同时利用DIANA,miRTarBase,TargetScan,miRDB数据库预测miR-328-5p靶基因,并与上述通路信息相结合,本研究最后确定ERBB2为miR-328-5p的靶基因。随后在细胞水平上,本研究证实:1. NP细胞中过表达miR-328-5p可以下调ERBB2的表达,而circ-GRB1O可以抑制miR-328-5p作用,上调NP细胞中ERBB2的含量;2.在NP细胞中抑制circ-GRB1O的表达,可以下调ERBB2的含量,并且促进NP细胞的凋亡。[结论]1.本研究表明大量circRNA参与了 IDD的发生、发展过程,并且circ-GRB 10作为IDD过程中的关键circRNA具有抑制NP细胞凋亡的重要作用。2.揭示了 circ-GRB10-miR-328-5p-ERBB2调控网络的平衡在NP细胞凋亡过程中的重要作用。3.为IDD的发生、发展过程中相关机制的研究提供了新的思路。