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第一部分二烯丙基三硫化物(DATS)对人膀胱癌T24细胞增殖的影响目的研究大蒜提取物二烯丙基三硫化物(DATS)于体外对人膀胱癌细胞系T24细胞增殖和细胞周期的影响及其可能机制。方法采用MTT法观察不同浓度的DATS(10,20,40,和80μmol/L)作用不同时间(24,48和72h)后对T24细胞增殖的影响。同时应用集落形成试验观察不同浓度的DATS(0,0.5,1,5,10,20和40μmol/L)对T24细胞集落形成的影响。T24细胞经不同浓度DATS(10,20,40,和80μmol/L)作用24小时后,采用流式细胞仪进行细胞周期分析。并应用Western blotting方法检测细胞周期相关蛋白Cdc25C的表达,以观察DATS对其的影响。结果1.DATS对T24细胞的增殖有明显的抑制作用,MTT法显示随着药物浓度升高(2.5～100μmol/L)和作用时间的延长(24-72h)其抑制作用逐渐增强,作用24h后,5-100μmol/L的抑制率范围为13%～81%,而作用48h及72h后抑制率范围则分别升至25%～87%及31%～96%。呈明显剂量和时间依赖性。2.DATS抑制T24细胞集落形成,随着浓度增高集落形成率逐步下降,浓度为20μmol/L时集落形成抑制率已达100%。3.经流式细胞仪检测,不同浓度DATS(10-40μmol/L)作用T24细胞24h后,G2/M期细胞逐渐增多,表明DATS可引起G2/M期停滞,表现为剂量依赖性。4.不同浓度DATS(10-80μmol/L)作用T24细胞24h后,Cdc25C蛋白表达随药物浓度增加逐渐降低。结论DATS能显著抑制T24细胞增殖和集落形成,其抑制作用呈时间和剂量依赖性。DATS能显著抑制T24细胞中Cdc25C蛋白的表达,这可能是诱导T24细胞G2/M期停滞的分子机制之一。第二部分二烯丙基三硫化物(DATS)对人膀胱癌T24细胞凋亡的影响目的研究DATS在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞凋亡的诱导作用,并探讨其诱导凋亡的相关信号通路等分子机制。方法研究DATS抗膀胱癌增殖作用是否为诱导细胞凋亡所致。用光学显微镜及荧光染色形态学观察经DATS作用后T24细胞产生的凋亡形态学改变。并应用流式细胞仪(Annexin V/PI双染法)检测细胞凋亡率的变化。采用Western blotting方法检测不同浓度DATS(10,20,40,和80μmol/L)作用24小时后T24细胞中caspase-3、PARP等蛋白在诱导凋亡中的表达,同时进一步研究了诱导细胞凋亡的分子机理,包括细胞中抗凋亡的PI3K/Akt通路及Bcl-2家族蛋白的表达。结果1.DATS作用于T24细胞后明显诱导细胞凋亡并呈显著剂量依赖性。2.光学显微镜显示不同浓度DATS(10,20,40,和80μmol/L)作用于T24细胞24小时后使其细胞密度呈剂量依赖性降低。同时观察到凋亡细胞所具有的典型形态学改变。3.流式细胞仪(Annexin V/PI双染法)检测不同浓度的DATS(10～80μmol/L)对T24细胞作用24h后细胞凋亡呈剂量依赖性增加。细胞发生坏死比例为0.2%～1.3%,而发生凋亡的比例为6.2%～20.0%,较之对照组0.3%明显为高,且呈剂量依赖性。其中早期凋亡细胞比例为4.8%-12.2%,晚期凋亡细胞比例为1.4%～7.8%,均较之对照组为高。4.DATS作用于T24细胞后easpase-3和PARP均被激活,表现为proeaspase-3的减少和裂解的PARP片段(89KD)出现,并呈显著的剂量依赖性。5.DATS作用于T24细胞后p-PDK1,p-Thr308-Akt,和p-Ser473-Akt的表达逐渐降低,呈剂量依赖性,但t-Akt的表达不受影响。6.DATS作用于T24细胞后Bax和BAD表达逐渐增高,Bcl-2和Bcl-xL的表达逐渐降低,呈显著的剂量依赖性。而且Bax/Bcl-2的比例逐渐增高,呈显著的剂量依赖性。结论DATS能诱导T24细胞凋亡,凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。DATS诱导产生凋亡的机理可能通过抑制T24细胞PI3K/Akt信号通路的激活从而调节Bcl-2家族等蛋白并最终诱导凋亡发生。第三部分二烯丙基三硫化物(DATS)对人膀胱癌T24细胞侵袭转移的影响目的研究DATS于体外对人膀胱癌细胞系T24细胞侵袭转移能力的影响及其可能机制。方法应用MTT法检测DATS对T24细胞粘附纤维连接蛋白(fibronectin)能力的影响,应用Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭实验检测DATS对T24细胞侵袭能力的影响,并应用划痕愈合试验检测DATS对T24细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR方法检测不同浓度DATS(10,20,40,和80μmol/L)作用24小时后的T24细胞中MMP-9 mRNA和MMP-2 mRNA的表达。采用Western blotting方法检测不同浓度DATS(10,20,40,和80μmol/L)作用24小时后的T24细胞中MMP-9蛋白的表达。结果1.粘附试验表明DATS(10～80μmol/L)作用24小时后,能有效抑制T24细胞与细胞外基质的粘附,且随药物浓度增高,抑制作用增强。2.划痕试验显示DATS作用不同时间(0,12和24小时)对T24细胞迁移力的影响随浓度增加和时间的延长而增强,呈剂量和时间依赖性。3.侵袭试验表明DATS(10～80μmol/L)作用于T24细胞24h后,随着药物浓度的升高,T24细胞的侵袭力逐渐降低,呈剂量依赖性。4.DATS可减少T24细胞中MMP-9 mRNA和蛋白的表达,随药物浓度增高而表达减少,呈剂量依赖性。结论DATS能显著抑制T24细胞的粘附、迁移和侵袭能力。DATS的侵袭转移抑制能力可能与降低MMP-9的表达有关。