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猪作为我国重要家畜之一,从基因组大小和代谢来看,是最接近人类的哺乳动物。以猪体外早期胚胎为研究对象,研究其在胚胎植入前的发育规律,可提高胚胎体外培养存活能力与克隆动物生产效率。多种作用因子共同调节猪早期胚胎发育过程,从而保证胚胎的正常发育,而相关因子的调控起着关键性的作用。有研究表明,Rho相关的卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinases, ROCKs)在调节细胞骨架、细胞转录、细胞分泌和细胞凋亡方面均发挥着重要的作用。近来有大量研究表明参与ROCK参与调控卵母细胞的成熟和胚胎的发育的过程。本研究主要探讨ROCK1与ROCK2在猪体外胚胎发育中的作用及其对囊胚质量的影响。首先,我们通过实时定量PCR和免疫荧光染色检测了ROCK1和ROCK2在各期卵母细胞和胚胎中的表达与分布。结果显示,ROCK mRNA在猪卵母细胞成熟GV期至MⅡ期,以及猪早期胚胎发育的合子至桑葚胚期均有表达；从早期胚胎2细胞期到8细胞期ROCK1和ROCK2 mRNA显著增加,当囊胚形成时表达量开始降低,到囊胚时期几乎不表达。ROCK1的蛋白检测显示从猪卵母细胞GV期到胚胎4细胞期在细胞核中表达较强,从8细胞期开始均匀分布于细胞中,囊胚期表达量最低；ROCK2在GV期主要分布于细胞膜下,从MI期开始均匀分布于细胞中,8细胞期表达量降低。为了检测ROCK在胚胎发育中的作用,我们在胚胎培养过程中添加ROCK抑制剂Y27632及其激活剂LPA来干扰ROCK信号,以此研究ROCK对胚胎发育的影响。研究结果显示,随着Y27632浓度的提高,卵裂率和囊胚率下降,部分囊胚形态异常；当Y27632浓度达到15州时,不能形成正常的囊胚。与单独添加10μMY27632相比,同时添加10μM LPA可使囊胚率提高,而单独添加LPA的胚胎发育情况优于都不添加的对照组。ROCK的抑制或激活还对囊胚的细胞数目有影响,与对照组相比,Y27632处理组的囊胚细胞总数下降,内细胞团(Inner cell mass, ICM)和滋养层(Trophoblast, TE)的比例(ICM/TE)变大,TE细胞数减少,而ICM细胞数异常增多。为了找出ROCK在猪早期胚胎发育中的具体作用时期,我们在胚胎发育到2d后的不同阶段添加Y27632,结果显示,在胚胎发育的2-7d内,ROCK对囊胚的形成有作用,尤其是在2-3d胚胎卵裂与4-5d胚胎进行致密化的过程中,此时如果抑制ROCK会使囊胚难以形成。Y27632会对猪早期胚胎发育造成一定的阻碍,导致胚胎发育异常,囊胚率显著降低,囊胚细胞总数和ICM/TE比例改变。综合上述实验结果,可见ROCK在猪早期胚胎发育中有着重要作用,对维持胚胎发育到囊胚阶段是必不可少的,且在这期间ROCK1与ROCK2可能发挥着不同的生物学功能。