【摘 要】
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喜树是我国传统的药用植物,其主要生理活性物质是喜树碱。喜树碱有珍贵的医用价值,主要用于治疗胃癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌等疾病。由于从喜树中分离纯化的喜树碱含量很低,且喜树碱生物合成途径复杂,不能满足目前的市场需求,导致喜树碱的价格昂贵。因此,对喜树碱的生物合成途径的研究有助于提高喜树碱的产量。在喜树碱的生物合成途径中,多种细胞色素P450单加氧酶（P450s）在一系列催化反应起着很重要的作用,如羟
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喜树是我国传统的药用植物,其主要生理活性物质是喜树碱。喜树碱有珍贵的医用价值,主要用于治疗胃癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌等疾病。由于从喜树中分离纯化的喜树碱含量很低,且喜树碱生物合成途径复杂,不能满足目前的市场需求,导致喜树碱的价格昂贵。因此,对喜树碱的生物合成途径的研究有助于提高喜树碱的产量。在喜树碱的生物合成途径中,多种细胞色素P450单加氧酶（P450s）在一系列催化反应起着很重要的作用,如羟基化、氧化、碳-碳键断裂和脱氢反应等;而细胞色素P450还原酶（CPR）又决定着大多数P450s的催化活性,所以CPR对喜树碱生物合成途径的研究具有重要意义。本课题主要进行了以下几个方面的研究:1.通过共表达分析转录组数据和同源比对筛选得到喜树中的两条CPR基因序列,根据基因序列设计特异性引物,并分别以喜树悬浮细胞和喜树幼叶的c DNA为模板,利用PCR技术对喜树中两条CPR的开放阅读框进行克隆。同时利用生物信息学分析喜树CPR基因的基本特性,对基因结构进行分析发现两个喜树CPR的基因结构相对保守,喜树中两条CPR的编码序列都被17个内含子间隔成18个外显子。另外,通过在线的蛋白分析软件对喜树CPR进行了蛋白的结构理化性质分析,发现喜树中两种CPR主要由α-螺旋,无规卷曲和延伸链组成。喜树两条CPR蛋白都有一个跨膜螺旋区域。通过DNAMAN 6.0对喜树CPR进行氨基酸序列的多重比对,结果显示:喜树中两个CPR都含有膜锚定结构域、FMN结合结构域、P450结合结构域、细胞色素c结合结构域、FAD结合结构域和NADPH结合结构域。基于系统进化树分析,喜树CPR分为两类。Ca CPR1属于I类CPR,Ca CPR2属于II类CPR。2.将长春花裂环马钱子苷合酶基因的开放阅读框构建到半乳糖诱导型酵母双重表达载体p ESC-Leu2d的Bam H I/Xho I位点中,获得重组质粒p ESC-Leu2d-CYP72。再将Ca CPR1和Ca CPR2分别插入重组质粒p ESC-Leu2d-CYP72的Not I/Spe I位点中,获得酵母表达载体p ESC-Leu2d-Ca CRR1-CYP72、p ESC-Leu2d-Ca CRR2-CYP72。分别将载体p ESC-Leu2d、p ESC-Leu2d-Ca CPR1、p ESC-Leu2d-Ca CPR2、p ESC-Leu2d-CYP72、p ESC-Leu2d-Ca CRR1-CYP72和p ESC-Leu2d-Ca CRR2-CYP72转入酵母菌株MKP-0中进行诱导表达,以马钱子苷为底物进行酶促反应。通过HPLC-MS对酵母提取物进行定性分析,通过HPLC对酵母提取物进行定量分析,结果表明,Ca CPR1、Ca CPR2均能够为P450单加氧酶提供电子,协助P450单加氧酶在酵母体内完成催化功能。Ca CPR1、Ca CPR2对底物的转化率分别为23.09%和35.23%。3.本研究检测了野生型喜树不同组织中CaCPRs的特异性表达,Ca CPR1在叶片和根中表达量较高,大约是茎中表达量的2-3倍,在茎尖中表达量最低。Ca CPR2在幼叶中表达量最高,其次是在根中的表达,在成熟叶和茎中表达量较低,在茎尖中几乎检测不到。总的来说,Ca CPR1与Ca CPR2有比较相似的表达模式。另外,通过检测SA和Me JA诱导喜树不同组织中喜树碱生物合成途径中关键酶基因及P450还原酶基因转录水平的变化,发现Ca CPR1和其他植物中的I类CPR—样,其表达水平在诱导过程中几乎不显示较大变化,因此推测Ca CPR1属于组成型表达的基因。而Ca CPR2能够响应水杨酸和茉莉酸甲酯的刺激,表达量发生明显变化,CaCPR2可能属于诱导型表达的基因。
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