HBV属于嗜肝DNA病毒科，是有包膜病毒并含有大约3.2kb的环状双链DNA基因组。HBV感染可导致有或无临床表征的肝炎。虽然已经研发出预防性的高效疫苗，但是全球仍有大约3.5亿人是慢性HBV感染者并且有发展为晚期肝脏疾病以及肝癌的风险。HBV的有效清除依赖于患者的年龄和免疫状态，免疫应答低下导致持续性或者慢性HBV感染。因此，宿主的免疫应答在HBV感染过程中具有重要的作用。　　 一直以来，免疫学家们认为适应性免疫系统在HBV的清除和致病方面具有重要的作用，相比之下，作为天然免疫系统重要成分的NK细胞在HBV感染中的作用却不是很清楚。虽有文献表明清除小鼠的NK细胞导致HBV耐受的现象，以及急性HBV患者清除HBV的感染伴随着体内NK细胞活化的现象，但是对于HBV感染后NK细胞如何发挥抗HBV感染功能则知之甚少。近来，有很多关于NK细胞对适应性免疫系统调节的报道。但是HBV感染过程中NK细胞是否具有对适应性免疫系统的调节功能也不是很清楚。因而，NK细胞在HBV感染过程中是否具有重要的作用，以及NK细胞是否参与对后续适应性免疫应答的调节，以及两大免疫系统如何相互协调介导HBV的清除？这正是我们所关心的问题。　　 因此，本论文的研究目的在于研究HBV清除的免疫学机制，探讨HBV感染过程中是否需要NK细胞的参与，以及重点探索NK细胞是否介导对适应性免疫细胞的活化，以期为临床慢性HBV患者的治疗以及疫苗的研制提供新的策略。　　 在本论文中对小鼠尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2质粒，建立了小鼠急性HBV感染模型。利用该模型我们深入探讨了HBV清除的免疫学机制以及NK细胞如何诱导适应性免疫系统启动而清HBV感染。根据CD8-/-小鼠血清HBV相关抗原的检测以及体外阻断CD8+T细胞后上清中细胞因子的分泌情况评估CD8+T细胞在HBV清除中的作用;采用流式细胞术检测NK细胞的活化，以及利用NK细胞清除和转输实验证明NK细胞如何参与抗HBV感染;通过对缺陷小鼠的特定细胞清除及过继转输实验检测NK细胞对CD8+T细胞的影响;清除CD4-/-小鼠的NK细胞研究其是否参与NK细胞所介导的抗病毒及促进CD8+T细胞的活化;利用转输实验及流式细胞术检测NK细胞对CD4+T细胞的调节;通过抗体阻断实验进一步证明DCs亦受到NK细胞的调节。另外，通过肝内注射及尾静脉高压注射Ad-EGFP实验，以及手术摘除实验、体内外分析肝脏淋巴结细胞等实验验证肝脏淋巴结与肝脏的关系。利用免疫放射法(IRMA)定量检测小鼠血清中HBsAg，HBeAg，anti-HBs，HBVDNA以及ALT水平，以及H-E染色和免疫组化分析来WT小鼠以及缺陷小鼠中病毒的清除特点;CBA检测培养上清中细胞因子的变化;流式细胞术检测NK细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞以及DCs的表型变化以及胞内细胞因子的表达情况。通过上述一系列的研究方法，我们取得如下的实验结果:　　 1.CD8+T细胞参与无细胞病变性在HBV清除过程中具有重要的作用　　 通过对C57BL/6小鼠高压尾静脉注射20μgpAAV/HBV质粒，检测血清HBsAg，HBeAg，anti-HBs，HBVDNA以及ALT水平。结果表明HBV在感染小鼠体内能够实现HBV的复制，且表达HBV相关抗原，WT小鼠可在HBV感染后3-4周内清除病毒感染，但是不引起肝细胞损伤和淋巴细胞浸润，即为无细胞病变性感染模型，类似于人类急性HBV感染。为了进一步检测HBV的清除是否有免疫系统的参与，我们检测CD8-/-小鼠在该模型中的特点，提示CD8-/-小鼠血清HBsAg和HBeAg均明显高于WT小鼠。分离WT小鼠脾脏的淋巴细胞，体外用α-CD8抗体阻断CD8+T细胞的作用，导致脾脏淋巴细胞IFN-γ及TNF-α分泌能力均明显降低，上述结果表明提示CD8+T细胞对于急性HBV感染模型中HBV的清除具有重要的作用。　　 2.NK细胞来源的IFN-γ促进HBV的清除　　 我们在该模型中发现HBV质粒高压注射后第3天，脾脏NK细胞明显增加，且CD69表达亦明显增加。NK细胞在HBV质粒高压注射后第5天和第7天IFN-γ表达明显增加。为进一步研究NK细胞在HBV清除中的作用，我们清除WT小鼠体内的NK细胞，肝组织病理染色结果表明NK细胞清除小鼠的肝组织HBcAg表达以及血清HBsAg及HBeAg表达明显高于对照小鼠。同样NK细胞缺陷小鼠Nfi13-/-小鼠在HBV质粒高压注射后亦不能清除HBV感染，而且分别转输WT小鼠的NK细胞和GKO小鼠的NK细胞至Nfi13-/-小鼠，则发现转输WT小鼠的NK细胞其血清HBsAg低于转输GKO小鼠NK细胞组。另外对NK细胞清除小鼠尾静脉注射mIFN-γ可以明显降低NK细胞清除所导致血清HBsAg的升高。因此，上述结果表明NK细胞来源的IFN-γ是参与HBV清除的主要功能。　　 3.NK细胞来源的IFN-γ促进抗HBVCD8+T细胞免疫应答　　 上述结果提示HBV清除过程中既需要CD8+T细胞的参与，又依赖于NK细胞的作用。那么二者之间是否存在调节作用呢？我们清除WT小鼠体内NK细胞，发现CD8+T细胞数目明显减低;肝脏和脾脏CD8+T细胞CD44+CD62L（-）CD8+T表达以及分泌IFN-γ明显减低;(-)且NK细胞清除小鼠的肝脏HBV-特异性CD8+T细胞的活化明显减低。为了明确NK细胞分泌的IFN-γ促进CD8+T细胞的免疫应答，我们清除CD8-/-小鼠体内NK细胞，转输CFSE标记的CD8+T细胞，并同时向NK细胞清除CD8-/-小鼠体内分别转输WT小鼠的NK细胞以及GKO(Ifn-/-)小鼠的NK细胞，我们发现CFSE-CD8+T细胞在清除NK细胞的受体中的增殖以及分泌IFN-γ的能力与对照小鼠(不清除NK细胞组)相比均明显下降。转输WT小鼠的NK细胞则能促进CFSE-CD8+T细胞的增殖以及分泌IFN-γ。相比之下，转输GKO小鼠NK细胞其促进CFSE-CD8+T细胞的增殖及分泌IFN-γ的能力相对较弱。另外，转输CFSE-CD8+T胞至GKO小鼠体内，并对一些受体小鼠转输WT小鼠的NK细胞，结果表明转输WT小鼠的NK细胞的受体小鼠，其肝脏和脾脏中CFSE-CD8+T细胞的增殖及分泌IFN-γ明显增强。综上所述，NK细胞分泌的IFN-γ促进CD8+T细胞的免疫应答。　　 4.NK细胞促进抗HBV-CD8+T细胞的再次免疫应答　　 接下来，分选HBV质粒高压注射后第5天的脾脏CD8+T细胞并标记CFSE，分别转输至NK细胞清除小鼠及对照小鼠体内，24小时后对受体小鼠高压注射HBV质粒。发现NK细胞参于脾脏抗HBVCD8+T细胞的再次免疫应答。为了进一步佐证此观点，我们又分选了HBV质粒高压注射后第14天的肝脏CD8+T细胞并标记CFSE，分别转输至NK细胞清除小鼠及对照小鼠体内。同样发现NK细胞清除小鼠的肝脏和脾脏中CFSE-CD8+T细胞的增殖及分泌IFN-γ的能力明显下降。因此，NK细胞参于来自于肝脏或脾脏的抗HBVCD8+T细胞的再次免疫应答。　　 5.CD4+T细胞在NK细胞抗HBV感染及抗HBVCD8+T细胞活化中的作用　　 为了检测CD4+T细胞是否在NK细胞控制HBV的感染及调节CD8+T细胞的活化中发挥作用，我们检测Rag1-/-和CD4-/-小鼠清除HBV的情况，结果表明Rag1-/-和CD4-/-小鼠体内虽然存在NK细胞，但是其不能发挥抗HBV作用。进一步清除Rag1-/-和CD4-/-小鼠中NK细胞，发现血清HBsAg的亦无明显变化。而WT小鼠中NK细胞可控制HBV的感染。进一步实验发现CD4-/-小鼠体内NK细胞不能促进CD8+T细胞分泌IFN-γ，因为WT小鼠的NK细胞明显促进HBV特异性CD8+T细胞分泌IFN-γ。清除CD4-/-小鼠体内的NK细胞也不能明显改变CD4-/-小鼠体内CD8+T细胞分泌IFN-γ。因此我们认为CD4-/-小鼠的NK细胞间接抗HBV作用，以及间接调节CD8+T细胞。且NK细胞的抗病毒作用依赖于CD4+T细胞的存在。上述结果表明，CD4+T细胞不仅介导NK细胞的抗HBV感染，也参与其对CD8+T细胞的调节。　　 6.CD4+T细胞辅助产生抗HBVCD8+T细胞免疫应答　　 上述结果表明CD4+T细胞参与HBV的清除，我们进一步检测CD4-/-小鼠清除HBV的能力，结果表明CD4-/-小鼠血清HBsAg和HBeAg均明显高于WT小鼠，而且HBV质粒高压注射后第8周也不能清除HBV感染。提示CD4+T细胞也参与HBV的清除过程。转输小鼠的CD8+T细胞至Rag1-/-小鼠并不能帮助该小鼠清除HBV感染，提示CD8+T细胞抗HBV感染需要CD4+T细胞的辅助。另外，体外阻断小鼠脾脏CD4+T细胞的作用，亦导致脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ下调。因此，CD8+T细胞发挥抗HBV感染功能需要CD4+T细胞辅助。　　 7.NK细胞促进CD4+T细胞免疫应答　　 既然CD4+T细胞辅助CD8+T细胞抗病毒免疫应答，而且NK细胞也促进CD8+T细胞的免疫应答。CD4+T细胞与NK细胞之间可能存在调节关系。比较CD4-/-小鼠与WT小鼠中NK细胞的功能，结果表明CD4-/-小鼠中NK细胞的功能正常。进一步检测NK细胞是否调节CD4+T细胞的功能，转输CFSE标记的CD4+T细胞至CD4-/-小鼠体内，发现NK细胞清除导致CFSE-CD4+T细胞在受体小鼠的肝脏和脾脏的增殖及IFN-γ分泌明显减低。且分离来自于NK细胞清除小鼠的肝脏CD4+T细胞，体外经Core129肽段刺激，产生分泌IFN-γ的HBV-特异性-CD4+T细胞的能力亦明显减低。以上结果表明NK细胞不受到CD4+T细胞的调节，且NK细胞促进CD4+T细胞的抗HBV免疫应答。　　 8.NK细胞分泌的IFN-γ促进CD11b+DCs免疫应答　　 NK细胞清除小鼠脾脏CD11b+DCs明显减低，且CD11b+DCs表面CD86和CD80的表达也明显下降，且脾细胞IL-18，IL-15和IFN-α的mRNA表达水平明显下调。尾静脉注射IFN-γ以清除小鼠体内的IFN-γ，发现该小鼠脾脏CD11b+DCs的表达亦明显下降下降，且脾细胞IL-15和IFN-α的mRNA表达水平亦下调。因此，NK细胞分泌的IFN-γ亦促进脾脏CD11b+DCs的活化，其可能介导后续适应性免疫应答的活化。　　 9.肝脏淋巴结对于HBV免疫应答发生的影响　　 另外，通过对小鼠肝内注射以及高压尾静脉注射Ad-EGFP，发现肝脏门部右侧的淋巴结可以引流肝脏EFGP+细胞，提示肝脏淋巴结引流肝脏的细胞。并且发现肝脏淋巴结能产生抗HBV特异性免疫应答。进一步实验表明手术摘除肝脏淋巴结导致大约30％的HBV耐受小鼠出现，而摘除脾脏却不影响小鼠HBV感染情况。进一步确证了HBV感染模型中肝脏淋巴结发生抗HBV的免疫应答。检测HBV感染后肝脏淋巴结细胞表型，发现HBV感染后CD8+T细胞及DCs发生增殖。因此，肝脏淋巴结可以发生针对HBV特异性免疫应答。　　 综上所述，我们对成年雄性小鼠高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒，建立模拟人类急性HBV感染的小鼠HBV感染模型。通过研究我们详细阐述了HBV清除的免疫学机制，明确了NK细胞在HBV的清除中的重要作用，证明了NK细胞分泌的IFN-γ介导了后续适应性免疫的活化进而促进HBV的清除。另外，我们亦发现肝脏淋巴结在HBV感染中具有重要的作用，肝脏淋巴结能产生抗HBV特异性CD8+T细胞，为更好的解释HBV感染中的免疫学机制提供理论依据。