【摘 要】
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高级醇和乙酸乙酯是果酒中重要的风味物质,它们的含量对果酒的口感和品质都有重要影响。为探究桑葚酒中因醇高酯低而出现的易上头、口感不协调等问题,本文从代谢途径出发,通过敲除高级醇支链氨基酸分解途径中的支链氨基酸转氨酶基因BAT2和过表达乙酸乙酯生物合成途径中的醇乙酰基转移酶基因ATF1/ATF2,探究不同基因改造后对桑葚酒中高级醇和乙酸乙酯生成量的影响。主要研究内容和结果如下:（1）以实验室前期从桑葚
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高级醇和乙酸乙酯是果酒中重要的风味物质,它们的含量对果酒的口感和品质都有重要影响。为探究桑葚酒中因醇高酯低而出现的易上头、口感不协调等问题,本文从代谢途径出发,通过敲除高级醇支链氨基酸分解途径中的支链氨基酸转氨酶基因BAT2和过表达乙酸乙酯生物合成途径中的醇乙酰基转移酶基因ATF1/ATF2,探究不同基因改造后对桑葚酒中高级醇和乙酸乙酯生成量的影响。主要研究内容和结果如下:（1）以实验室前期从桑葚自然发酵液中选育的优良二倍体酿酒酵母S3为出发菌株,通过构建的重组质粒p UC-BAKB,扩增重组片段BA-Kan MX-BB并将其转化至S3中,经筛选验证后,成功获得缺失一个BAT2等位基因的重组菌株S3-1。（2）以重组菌株S3-1为出发菌株,再次敲除BAT2基因,获得缺失两个BAT2等位基因的重组菌株D3-1。通过将重组菌株S3-1、D3-1和出发菌株S3同时进行桑葚酒发酵,探究BAT2基因的缺失对桑葚酒中高级醇的影响,结果表明:D3-1的生长速率和最大生物量较S3有所减弱,S3-1无明显差异;S3-1和D3-1的CO2失重、总酸、还原糖和酒精度等基本发酵性能与S3均无明显差异;S3-1和D3-1的高级醇生成量较S3有明显下降,S3-1的总高级醇含量降低了20.97%,为359.33 mg/L;D3-1降低了31.63%,为310.85 mg/L。其中异丁醇和异戊醇的含量有明显地下降,S3-1中分别降低了27.42%、22.86%;D3-1中分别降低了40.53%、35.28%,正丙醇和β-苯乙醇无明显降低。（3）以S3为出发菌株,结合融合PCR等方法,构建缺失一个BAT2等位基因同时过表达ATF1的重组菌S3-A1,和缺失一个BAT2等位基因同时过表达ATF2的重组菌S3-A2。通过将重组菌株S3-1、D3-1、S3-A1和S3-A2和出发菌株S3同时进行桑葚酒发酵,探究在BAT2基因缺失的基础上过表达ATF1/ATF2基因对桑葚酒中高级醇和乙酸乙酯的的影响,结果表明:生长性能上,除D3-1有所减缓外,其他重组菌的生长趋势与S3均无显著性差异;基本发酵性能上,所有重组菌与S3都无显著性差异;高级醇含量上,S3-A1下降最多,降低了40.77%,为268.68 mg/L,S3-A2下降了21.23%,为357.27 mg/L,S3-1和D3-1则分别下降了17.29%和27.49%;乙酸乙酯含量上,S3-A1和S3-A2上升明显,其中S3-A1升高了25.38倍,为711.35 mg/L,S3-A2升高了2.09倍,为83.37 mg/L,S3-1和D3-1无明显上升。（4）通过正交优化重组菌株S3-A2的桑葚酒发酵条件,来进一步降低其高级醇产量。结果表明:在初始糖浓度21°Brix,酵母接种量5%,发酵温度28℃的最佳条件下,S3-A2所发酵的桑葚酒,其高级醇含量为315.43mg/L,相较于对照组无显著变化,相较于优化前降低了11.71%。而优化后的其他基本发酵性能和乙酸乙酯含量均能达到正常范围,相较优化前无显著变化。
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