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目的：肿瘤的化疗是肿瘤综合治疗的重要组成部分。许多研究表明,化学药物主要通过诱导肿瘤细胞的凋亡达到治疗目的,能否诱导肿瘤细胞凋亡成为评价抗癌药物疗效的重要标志,但许多化疗药物都面临着肿瘤细胞产生耐药的问题。目前的研究多集中在多药耐药基因的表达与肿瘤耐药间的关系,但有研究显示多倍体肿瘤对常用的放疗、化疗极不敏感,而具有多倍体亚克隆的肿瘤预后更差。纺锤丝毒性药物(紫杉醇／长春新碱/Nocodazole)是许多肿瘤化疗的一线药物。由此提示我们这些纺锤丝毒性药物诱导形成的多倍体很可能与肿瘤耐药发生相关。通常正常细胞周期进程中如出现异常(如形成多倍体)会启动凋亡通路。即使肿瘤细胞也存在多种正常的细胞周期调控机制。前期研究发现,在用纺锤丝毒性药物处理细胞时,有些细胞以发生凋亡为主,有些细胞以形成多倍体为主。为何一些细胞会出现有丝分裂滑动而导致多倍体(四倍体)的产生?为何这些多倍体细胞未激活细胞凋亡机制?分析起来可能与细胞周期的失调控和细胞凋亡通路受到抑制有关。Bcl-2家族是哺乳动物细胞中调节凋亡的重要因子,目前研究认为Bcl-2基因及其相关蛋白高表达抑制细胞凋亡是肿瘤发生和产生耐药现象的重要因素之一。因此,从凋亡的角度出发对Bcl-2、Bax在Nocodazole诱导多倍体肿瘤的发生和发展进行研究有较大的意义。是否凋亡通路的异常是导致多倍体形成的真正原因呢?又是那些分子在控制着凋亡通路呢?本实验通过应用细胞有丝分裂阻滞剂Nocodazole为诱导物,以两株对该药反应截然不同的乳腺癌细胞为研究对象(一株MDA-MB-231以形成多倍体细胞为特点,一株Hcc1806以凋亡为特点),在与药物共同孵育的不同时间点收获细胞,确定细胞周期并检测细胞凋亡通路蛋白Bcl-2/Bax在Nocodazole诱导多倍体肿瘤形成中的表达,并初步探讨了其可能的分子机制。方法：1、实验分组：用Nocodazole处理两株乳腺癌细胞系MDA-MB-231和HCC1806在药物作用后0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h,根据不同时间点收获细胞,并以不加药细胞为空白对照。2、细胞周期的检测：PI染色流式细胞仪检测Nocodazole对MDA-MB-231和HCC1806细胞周期阻滞的影响,进行细胞周期分析,确定细胞周期。3、细胞凋亡的检测：倒置显微镜和透射电子显微镜下分别观察MDA-MB-231和HCC1806对照组,及Nocodazole处理后不同时间点收获的MDA-MB-231和HCC1806细胞后的形态学变化；PI染色流式细胞仪检测Nocodazole对MDA-MB-231和HCC1806细胞凋亡的影响；Westen Blot检测细胞凋亡执行分子caspase9,caspase3的剪切情况。4、蛋白质印迹法检测MDA-MB-231和HCC1806对照组,及Nocodazole处理后不同时间点收获的MDA-MB-231细胞和HCC1806细胞中Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达。结果：1、Nocodazole对MDA-MB-231和HCC1806细胞周期的影响流式结果显示,Nocodazole作用HCC1806后以凋亡为特点；MDA-MB-231细胞在接触该类药物6h开始出现G2／M期停滞,24h完全停滞在G2／M期,24h后多倍体形成增多,72h以多倍体为主。2、Nocodazole对MDA-MB-231和HCC1806细胞凋亡的影响Nocodazole作用MDA-MB-231和HCC1806细胞6h后,细胞开始变圆,24h后细胞全部变圆,HCC1806细胞随着接触药物时间的延长,细胞体积逐渐变小、变形,胞核皱缩,细胞漂浮,凋亡小体形成等典型的凋亡形态学变化,这类细胞随着与药物接触时间延长逐渐增多,72h后以凋亡小体形成为主；而MDA-MB-231细胞随着接触药物时间的延长,出现细胞体积增大,细胞核大等典型的多倍体形态学变化的细胞逐渐增多,72h后以多倍体形成为主。Westen Blot结果显示,HCC1806细胞在药物作用24h出现凋亡标志蛋白caspase9、Caspase3的表达,MDA231未检测出caspase9、caspase3的表达。3、MDA-231和HCC1806细胞中Bcl-2/Bax蛋白的表达蛋白质印迹法检测显示,Bax蛋白在HCC1806细胞中持续表达,药物作用36h、48h时表达量明显增加；Bcl-2在HCC1806细胞中亦有表达,24h后表达增加,bcl-2/bax比值于24h、36h明显下降；Bax在MDA231中无表达,与对照组比,Bcl-2在MDA231细胞中药物作用24h后表达量明显增加直至72h。结论：Bcl-2蛋白高表达阻止了纺锤丝毒性药物诱导的乳腺癌细胞凋亡,很可能是多倍体肿瘤形成的主要原因之一,及肿瘤耐药的重要机制。