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该实验希望通过对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)这一研究中枢神经系统疾病常用的模型细胞在类缺血再灌注损伤时Ca2水平和NF-κB表达变化的观测,探讨Ca<2+>介导类缺血再灌注损伤PC12细胞NF-κB激活的可能机制.该实验分为两部分:第一部分包含实验一和实验二,主要内容是PC12细胞类缺血再灌注损伤模型的建立,以及细胞内Ca<2+>浓度和NF-κB表达变化的检测.将常规传代培养的PC12细胞放入自制的类缺血装置中进行类缺血处理,运用流式细胞仪检测不同时间点凋亡细胞的比例,并在倒置显微镜下观察细胞形态,取凋亡细胞比例开始显著增大的时间作为后续实验中类缺血处理的标准时间;按照标准时间将PC12细胞进行类缺血处理,然后进行不同时间的再灌注处理,运用激光共聚焦显微镜观测各时间点的胞内Ca<2+>浓度,并用免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测各时间点NF-κB的表达.第二部分包含实验三和实验四,运用细胞膜Ca<2+>通道阻断剂氟桂利嗪和Ca<2+>/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca<2+>/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,Ca<2+>/CaM PKⅡ)竞争性抑制剂KN-93分别进行干预,检测Ca<2+>浓度和NF-κB表达的变化情况,并对细胞活性进行检测.将培养的PC12细胞随机分为氟桂利嗪组、单纯类缺血再灌注组和阴性对照组,将氟桂利嗪组施加氟桂利嗪预处理后和单纯类缺血再灌注组一起进行类缺血再灌注处理,运用激光共聚焦显微镜观测三组细胞的胞内Ca<2+>浓度,用免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测各时间点NF-κB的表达,用甲基噻唑蓝(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)比色法对三组的细胞活性进行检测;同样的将PC12细胞随机分为KN-93组、单纯类缺血再灌注组和阴性对照组,将KN-93组施加KN-93预处理后和单纯类缺血再灌注组一起进行类缺血再灌注处理,用免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测各时间点NF-κB的表达,用MTT比色法对三组的细胞活性进行检测.