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研究背景光是一把双刃剑，一方面人们的生活离不开光，另一方面光又因其生物学作用不可避免的对人体产生伤害。日光中紫外线可引起日晒红斑、日晒黑、光老化、光敏性皮肤病甚至发生癌症。衰老是一种不可避免的自然规律，在皮肤上主要表现为皮肤粗糙、增厚、松弛，自然因素或非自然因素均可导致皮肤衰老的发生。皮肤衰老的研究一直是近年来的热点，尽管已鉴定出许多衰老相关蛋白，但衰老的信号通路及其调节机制尚不清楚。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。miRNA芯片技术是一种快速有效检测miRNA表达谱的方法，经此方法筛选出的差异表达的miRNA，可通过质粒、腺病毒、慢病毒转染等方式上调/下调其表达，进一步进行功能学研究。目的本研究将采用多次低剂量UVB照射HDFs的方法，构建应激诱导的提前衰老（UVB-stress induced premature senescence, UVB-SIPS）模型，然后通过microRNA芯片技术筛选该模型中差异表达的miRNA并进行生物信息学分析，找出用UVB照射HDFs构建的UVB-SIPS模型中差异表达miRNA，并对其中感兴趣的miRNA-34c与老化相关基因p53、p21、p16及sirt1在UVB-SIPS中的作用进行初步研究。方法1.建立及验证UVB照射诱导的人皮肤成纤维细胞提前衰老模型取健康青少年男子环切术切除的包皮，分离真皮HDFs后进行传代培养，取10-15代细胞进行实验，采用不同剂量的UVB照射细胞，观察细胞衰老-β-半乳糖苷酶染色（SA-β-Gal）、G1期阻滞率及细胞凋亡率，以筛选最佳UVB照射剂量；并用Real-time PCR及western blotting检测UVB-SIPS模型中衰老相关基因p53、p21、p16及sirt1的mRNA和蛋白表达。2. microRNA芯片筛选差异表达的microRNA及生物信息学分析首先进行microRNA芯片分析，以归一化强度的|log2（Ratio）|≥2和P <0.05为条件筛选上述UVB-SIPS模型中差异表达的miRNA，通过TargetScan数据库对部分差异表达的miRNA进行靶基因预测，并对所得靶基因进行基因功能的显著性分析（GO-Analysis），构建miRNA与基因调控网络，从而得出该网络中具有重要调控地位的核心miRNA和被调控的关键靶基因，并分析其基本功能。3. miR-34c在UVB照射诱导的提前衰老模型中作用机制的研究根据生物信息学分析结果与文献报道，选择UVB照射后表达上调的miR-34c为切入点，运用慢病毒感染技术沉默miR-34c的表达，再以前述所筛选出的最佳UVB剂量照射HDFs诱导提前衰老，观察衰老相关生物学指标SA-β-Gal、细胞周期阻滞率以及衰老相关基因p53、p21、p16及sirt1的mRNA及蛋白表达。结果1.总剂量50mJ/cm2的UVB平均分5日照射后3d，可诱导人皮肤成纤维细胞进入提前衰老状态接受不同照光剂量（25mJ/cm2、50mJ/cm2、75mJ/cm2）的HDFs其SA-β-Gal阳性率及G1期阻滞率均明显高于空白对照组（P<0.05），以总剂量25mJ/cm2、50mJ/cm2的UVB照射的HDFs其凋亡率与空白对照组无明显差异。当UVB照射总剂量达75mJ/cm2可明显引起细胞凋亡（P＜0.05）。依此选择构建诱导UVB-SIPS模型的最佳照射总剂量为50mJ/cm2，平均分5日照射，每日剂量为10mJ/cm2。2. miRNA芯片筛选出UVB-SIPS模型中差异表达的miRNA相对于空白对照组细胞，在UVB-SIPS组细胞中以|log2（比）|≥2和P<0.05为标准选择有显著表达差异的miRNA，筛选出8个上调的miRNA，分别为hsa-miR-1224-3p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-1976、has-miR-23a-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-4701-5p、hsa-miR-574-5p和hsa-miR-766-3p；5个下调的miRNA，分别为hsa-miR-1185-1-3p、hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-4638-5p、hsa-miR-4695-5p和hsa-miR-933。对上述miRNA进行生物信息学分析，并通过TargetScan数据库预测这些miRNA的靶基因，构建miRNA与基因调控网络，从而得到该网络中具有重要调控地位的核心miRNA和被调控的关键靶基因。通过生物信息学分析发现上调miRNA预测靶基因功能主要集中于能量代谢、免疫反应、色素代谢等，下调miRNA预测靶基因功能主要集中于成纤维细胞增值功能负调控、跨膜信号传导等。3. miR-34c对UVB照射诱导的人皮肤成纤维细胞提前衰老有促进作用。运用慢病毒感染HDFs沉默miR-34c表达后再次予前述构建UVB-SIPS模型相同UVB剂量照射，SA-β-Gal阳性率及G1期阻滞率均较单纯UVB照射组降低（P<0.05），老化相关基因p53、p21、p16及sirt1的mRNA及蛋白表达均较单纯UVB照射组降低（P<0.05）。结论综上所述，miR-34c通过影响老化相关基因p53、p21、p16及sirt1mRNA及蛋白的表达，对UVB照射诱导的HDFs提前衰老具有促进作用。