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第一部分Wntless/GPR177参与小鼠胚胎原肠胚形成与心脏发育背景:小鼠早期胚胎发育包括原肠胚形成和器官发生,这些过程需要多条信号通路包括Wnt、BMP、Nodal、FGF等之间精细的协调。β-catenin作为Wnt配体的共同下游信号分子,与Wnt蛋白一同在小鼠原肠胚形成和器官发生中起着至关重要的作用。Wnt信号通路在胚胎发育及器官发生中的作用已经在多年来的研究中被反复验证,Wnt信号通路的异常调节将严重影响胚胎发育,前人实验证明敲除Wnt3可导致最早的胚胎发育异常,也印证了Wnt信号通路在胚胎发育中的重要地位。相比于Wnt接收型(Wnt-receiving)细胞中的研究,大家对Wnt生产型(Wnt-producing)细胞的研究还十分欠缺。Wntless/GPR177在前人的研究中已被报道参与调节Wnt配体的成熟,分选和分泌等。在全身剔除Wntless(Wls)将严重影响胚胎体轴形成。目的:探讨Wntless在胚胎原肠胚形成和心脏发育中的作用及其影响的生物学过程。方法:使用多种特异性表达的Cre,剔除上胚层、生心区中胚层、心脏前体细胞中的Wls,利用HE染色实验观察其形态学变化,全胚原位杂交实验检测剔除Wls后的相关基因表达情况,利用免疫荧光实验检测Wnt信号通路、上皮-间充质转化过程以及细胞凋亡情况的变化。结果:在上胚层剔除Wls后明显阻断了上皮-间充质转化过程这一胚层分化中的关键步骤,表现为被剔除Wls的上胚层中E-cadherin和N-cadherin上升。同时β-catenin蛋白表达模式变化及表达水平明显下降,说明Wls对于维持胚胎的β-catenin的表达量和表达模式具有十分重要的作用。此外,被剔除Wls的上胚层中细胞凋亡明显增加。不论是在生心区中胚层还是在心脏前体细胞中条件性剔除Wls都导致严重的心脏发育缺陷和胚胎死亡,也证明Wls对胚胎心脏发育同样十分重要。结论:1.于上胚层中特异性剔除Wls可导致胚胎由于上皮-间充质转化这一过程异常,原肠胚形成不能进行,胚胎于胚龄8.5d死亡。2.于生心区中胚层中条件性剔除Wls可导致胚胎心脏于胚龄10.5d即出现严重的发育异常。3.于心脏前体细胞中条件性剔除Wls后表现为胚胎心脏的室壁变薄,胚胎死亡。第二部分主动脉根部和肺动脉干的第二生心区来源细胞的异质性背景:小鼠胚胎心脏发育起始于第一生心区(First Heart Field,FHF)形成原始心管,此后来自第二生心区(Second Heart Field,SHF)的心脏前体细胞逐渐由心管两端向内迁入,促使原始心管快速增长并向右成襻。转基因动物研究显示FHF来源的心肌细胞参与形成左心室和部分心房,而SHF来源的细胞则参与形成流出道、右心室及部分心房及静脉窦。流出道在形成后经过分隔和重塑形成升主动脉和肺动脉干,流出道的异常发育常导致升主动脉和肺动脉干发育异常等严重的复杂的先天性心脏病。研究证实鸡胚、小鼠胚胎SHF前体细胞存在区域差异,不同区域的前体细胞分别分化为肺动脉圆锥和主动脉前庭的心肌。上述研究提示流出道内分布的SHF来源细胞在进入流出道之前就已经确立了分化方向,但关于SHF来源细胞在两动脉内分布、分化等的命运决定尚未阐明。目的:研究SHF来源细胞对主动脉根部和肺动脉干时空贡献的差异。描绘流出道分隔期间SHF来源细胞向主动脉根部和肺动脉干的分配情况。探讨主动脉根部和肺动脉干内SHF来源细胞是否存在异质性。为先心病病因探索及新型治疗方法打下基础。方法:Mef2c-AHF-Cre和Mef2c-AHF-Cre-ERT2小鼠与Rosa26-Tomato/GFP(m Tm G)小鼠杂交以获得Mef2c-AHF-Cre;m Tm G和Mef2c-AHF-Cre-ERT2;m Tm G胚胎。为了激活诱导型Cre的重组活性,通过腹腔注射对孕鼠行他莫昔芬干预。在胚胎胚龄10.5d,胚龄11.5d,胚龄12.5d时分别收集胚胎,分析GFP+细胞在流出道或主动脉根部、肺动脉干的分布情况。结果:本研究发现在流出道分隔后,主动脉根部和肺动脉干中的Mef2c+AHF来源细胞分布几乎已经决定,并且具有不同的分布模式,主动脉根部仅外1/3层为Mef2c+AHF细胞来源,而肺动脉干中几乎完全由Mef2c+AHF来源细胞组成。谱系示踪发现存在两批Mef2c-AHF+细胞分别倾向于分布至主动脉根部和肺动脉干。倾向于分布至主动脉根部的Mef2c-AHF+细胞出现得更早,而倾向于分布至肺动脉干的Mef2c-AHF+细胞出现得较晚。结论:1.主动脉根部和肺动脉干管壁内Mef2c-AHF+来源细胞的分布模式不同:主动脉根部管壁外1/3层由Mef2c-AHF+细胞构成,而肺动脉干管壁几乎全部由Mef2c-AHF+细胞构成。2.Mef2c-AHF+细胞分为不同亚群参与主动脉根部和肺动脉干管壁发育:流出道内Mef2c-AHF+来源细胞在流出道分隔前就已经被预设了迁移定位,分布于主动脉根部的Mef2c-AHF+来源细胞在小鼠胚龄7.5d进入流出道,而参与肺动脉干发育的Mef2c-AHF+细胞进入流出道的时间较晚。