【摘 要】
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鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）是一种对雏鸭高度致死的病毒性疾病,其传染性强、死亡速度快,严重危害养鸭业。鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）是鸭肝炎病毒的主要血清型,我国目前主要流行的是DHAV-1和DHAV-3两种基因型,近年来DHAV-3逐渐取代DHAV-1成为我国广泛流行的基因型。关于DHAV-3的主要衣壳蛋白VPO的抗原
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鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）是一种对雏鸭高度致死的病毒性疾病,其传染性强、死亡速度快,严重危害养鸭业。鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）是鸭肝炎病毒的主要血清型,我国目前主要流行的是DHAV-1和DHAV-3两种基因型,近年来DHAV-3逐渐取代DHAV-1成为我国广泛流行的基因型。关于DHAV-3的主要衣壳蛋白VPO的抗原优势区尚无系统报道。将本研究构建的pET-30a-DHAV-3-VP0重组原核表达质粒,及实验室保存的pET-32a-DHAV-3-VP0 和携带 DHAV-3-VP0 4 段截短基因的 pET-32a-DHAV-3-VP0-1/-2/-3/-4,进行了原核表达并纯化了两种r-DHAV-3-VP0、四种r-DHAV-3-VP0-1/-2/-3/-4截短蛋白等6种重组蛋白。以pET-30a-DHAV-3-VP0表达的重组蛋白为免疫原免疫成年SPF鸭,制备鸭抗DHAV-3-VP0多克隆抗体并测定其中和效价为1:19,表明鸭抗DHAV-3-VP0具有中和抗原表位可刺激鸭产生中和抗体。分别以pET-32a-DHAV-3-VP0和pET-32a-DHAV-3-VP0-1/-2/-3/-4表达的重组蛋白为检测抗原,以制备的鸭抗DHAV-3-VP0多克隆抗体及鸭抗DHAV-3阳性血清为第一抗体,进行Western blot和间接ELISA检测重组蛋白的免疫反应性,结果表明r-DHAV-3-VPO及r-DHAV-3-VP0-1/-2/-3/-4均与上述血清发生特异性反应,证明DHAV-3-VP0及其截短蛋白具有良好的免疫反应性,其中r-DHAV-3-VPO的免疫反应性强于r-DHAV-3-VP0-1/-2/-3/-4,且4段截短蛋白中以DHAV-3-VP0-1（1-59 aa）反应性最强,因此确定该段为DHAV-3-VP0的特异性抗原优势区。同时,以不同时间点采集的鸭抗DHAV-3-VP0多克隆抗体及鸭抗DHAV-3阳性血清为第一抗体,进行间接ELISA检测血清抗体的消长规律,结果表明所有截短蛋白的抗体水平均低于针对DHAV-3-VP0的抗体水平,DHAV-3-VP0-1的抗体水平高于其他3段截短蛋白的抗体水平,且DHAV-3-VP0的抗体与DHAV-3-VP0-1的抗体水平变化规律一致,进一步证实DHAV-3-VP0-1（1-59 aa）为DHAV-3-VP0的特异性抗原优势区。最后,以纯化后的r-DHAV-3-VPO免疫5日龄SPF雏鸭,分别设置0.1 mg和0.2 mg两个免疫组,10天后攻击1000 ELD50的DHAV-3鸭胚毒,连续观察7天,攻毒对照组在攻毒后第4天全部死亡,组织病理切片观察可见肝脏、心脏与脑组织发生明显组织损伤;免疫组可抵抗DHAV-3的攻击,且存活率呈现免疫剂量依赖性,0.1 mg和0.2 mg免疫组雏鸭攻毒后第7天存活率为分别为50%和83.3%,且0.2mg免疫组攻毒后组织病理切片观察肝脏、心脏与脑组织的组织损伤程度与对照组相比显著降低,说明DHAV-3-VP0蛋白提供一定的免疫保护力,可缓解致死量DHAV-3对雏鸭的致死作用。综上所述,DHAV-3-VP0具有免疫反应性,其中DHAV-3-VP0-1（1-59 aa）为DHAV-3-VP0的抗原优势区。同时DHAV-3-VP0不仅有免疫原性,也具有一定的免疫保护性。本研究为阐明DHAV-3-VP0的免疫特性提供理论依据,为今后开发基于VP0联合其他结构蛋白的优势表位疫苗及诊断试剂以有效预防DHAV的流行奠定理论及物质基础。
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