与正常细胞相比,癌细胞需要更高水平的活性氧(ROS)和氧化还原活跃的铜来维持其恶性表型,呈现出“改变”的氧化还原状态。这一差异衍生出一种与传统抗氧化治疗完全相反的促氧化抗癌策略,即通过促进胞内ROS的生成、崩溃癌细胞不正常的氧化还原平衡,实现选择性杀死癌细胞。然而这个策略也提出了“如何设计天然产物导向的促氧化抗癌试剂以及是否具有可行性”的科学问题。因此,本论文从促氧化的角度选择和设计类黄酮、荜茇酰胺、姜黄素、[6]-姜烯酚、内屈考诺酮、考布他汀等天然产物导向的抗癌试剂,研究其相关的化学和生物学机制,为“如何设计促氧化的抗癌试剂”提供了相关信息。主要研究内容如下:(1)通过Cu(Ⅱ)载体在癌细胞内富集Cu(Ⅱ),进而崩溃其不正常的氧化还原平衡并诱导其死亡,是一种重要的促氧化抗癌策略。我们选择天然产物类黄酮作为研究对象,探究其作为Cu(Ⅱ)载体的可行性、结构基础、化学驱动力和相关的生物学效应。实验结果表明:类黄酮凭借其3(5)-羟基-4-酮基的结构单元成为有效的Cu(Ⅱ)载体。3-羟基黄酮(3-HF)是比5-羟基黄酮(5-HF)更为有效的Cu(Ⅱ)载体,与Cu(Ⅱ)更加显著地协同诱导癌细胞死亡。我们也揭示了3-HF作为Cu(Ⅱ)载体在癌细胞内外穿梭并源源不断地向胞内“运输”Cu(Ⅱ)的化学驱动力(包括其络合Cu(Ⅱ)的驱动力,在胞内释放Cu(Ⅱ)的驱动力及重新扩散至胞外的驱动力)。其络合Cu(Ⅱ)的驱动力在于:经历质子优先损失的机理络合Cu(Ⅱ),将Cu(Ⅱ)以电中性的形式运输至胞内。络合物在胞内释放Cu(Ⅱ)的驱动力在于:胞内主要的抗氧化剂—GSH与3-HF相比是更为优异的Cu(Ⅱ)配体,它与Cu(Ⅱ)络合并发生氧化还原反应生成GSSG和Cu(I),导致了氧化还原响应的铜释放。重新扩散至胞外的驱动力在于:3-HF的酸度常数p Ka(它在Cu(Ⅱ)存在下为5.7,在无Cu(Ⅱ)的条件下为10.4)导致络合物解离后得到3-HF的氧负离子非常容易在中性条件下被质子化,并以电中性的形式扩散至胞外,在胞外Cu(Ⅱ)的辅助下再次经历质子优先损失的机理络合新的Cu(Ⅱ),将其运输至胞内。上述过程的循环发生导致胞内铜不断富集,耗尽GSH和缓冲应激的能力并伴随着ROS的生成,最终导致细胞经历经典的线粒体途径凋亡。类黄酮与Cu(Ⅱ)形成的络合物在某种程度上可视为“特洛伊木马”扰乱了细胞的氧化还原编程。该工作首次揭示了类黄酮作为Cu(Ⅱ)载体的结构基础和化学驱动力,为3(5)-羟基黄酮的癌预防活性机制提供了一种新的解释,也为“设计铜介导的促氧化抗癌试剂”提供了相关信息。(2)含Michael加成受体单元的亲电试剂能与维持胞内氧化还原平衡的蛋白的亲核中心发生共价作用,改变胞内的氧化还原状态,可视为另一类重要的促氧化剂。据此我们选择荜茇酰胺为先导分子,在其内酰胺环上的Michael受体单元的a-位引入吸电子的氯原子(PL-CL),适度提高其亲电性。发现该分子比母体分子具有更为优异的选择性杀死癌细胞的能力。化学生物学机制研究表明:它比母体分子更为有效地靶向控制细胞氧化还原平衡的硫氧还蛋白还原酶(Trx R),转变该抗氧化酶为ROS生成剂,导致人肺癌细胞A549内ROS(包括O2.-和H2O2)的大量爆发及胞内氧化还原缓冲体系的瓦解,并以ROS依赖的方式激活p53-p21-cyclin A/CDK2通路介导细胞周期阻滞在S期和激活ASK1-JNK/p38通路介导线粒体途径依赖的凋亡;重要的是,该分子具有优异的选择性,在正常细胞(人胚胎肺成纤维细胞WI-38)中并不影响上述信号途径。随后,我们以姜黄素为先导分子,基于亲电性的促氧化策略和通过Knoevenagel缩合消除其不稳定的活性亚甲基单元设计其类似物2a。发现该分子具有比母体分子更高的亲脂性、稳定性、亲电性和诱导人肝癌细胞Hep G2死亡活性。机制研究表明:该分子能凭借其Michael受体单元更加有效地靶向Trx R,导致ROS(H2O2)的爆发及细胞内氧化还原缓冲系统的崩溃,从而激活ASK1-MAPK信号通路诱导线粒体途径的细胞凋亡。此外,该分子也能诱导细胞自噬性死亡并部分贡献着其细胞毒活性。其次,我们同样以姜黄素为先导分子,基于亲电性的促氧化策略设计邻位双三氟甲基取代的双查尔酮BC2。发现该分子具有比姜黄素更为显著的抑制癌细胞增殖和诱导人肺癌细胞A549凋亡活性。机制研究表明:该分子能凭借其Michael受体单元导致ROS(H2O2)的爆发及细胞内氧化还原缓冲系统的崩溃,从而激活MAPK信号通路诱导线粒体途径的细胞凋亡。最后,我们以[6]-姜烯酚为先导分子,在其C1-C2位上进一步引入双键,从提高亲电性的角度设计其类似物[6]-脱氢姜烯酚。发现该分子具有比母体分子和[6]-姜酮酚更强的诱导Hep G2死亡活性,其活性和机制与Michael加成受体单元数目和亲电性正相关。上述三部分工作分别以荜茇酰胺、姜黄素和[6]-姜烯酚为例诠释了基于亲电性的促氧化策略设计天然产物导向的抗癌试剂的可行性和重要性。(3)最为活泼、对细胞损伤最大的ROS是羟基自由基。广为接受的羟基自由基产生机理是过渡金属催化的Fenton反应。Zhu等先前发现了一种独立于金属离子通过H2O2和卤代醌产生羟基自由基的机制:即H2O2亲核进攻卤代醌,形成氢过氧化物的中间体;随后均裂产生羟基自由基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA2007,104,17575)。考虑到癌细胞含有高水平的H2O2,我们试图设计一类特殊的亲电体促氧化剂—卤代醌,实现胞内H2O2响应的羟基自由基产生并选择性地杀死癌细胞。我们在保留天然产物内屈考诺酮(Conocurvone)母核的基础上设计了双氯代联萘醌BQ-DC。以人肺癌细胞A549和人正常肝细胞L-02为模型,发现它能利用癌细胞中高水平的H2O2,原位产生强毒性羟基自由基,实现选择性地杀死癌细胞。羟基自由基在胞内的产生的证据包括:(I)抗氧化剂a-生育酚因羟基自由基的强反应性,并不能有效抑制双卤代联醌的细胞毒性;(Ⅱ)双卤代联醌与H2O2协同抑制细胞增殖;(ⅡI)通过文献报道的羟基自由基专一的荧光探针香豆素-花青素杂合体和罗丹明氮氧自由基检测到胞内羟基自由基的形成;(IV)EPR实验检测到胞内羟基自由基的形成。此外,BQ-DC作为亲电体消耗GSH、靶向Trx R和醌氧化还原酶NQO1,进而产生ROS也贡献着其细胞毒性。(4)考布他汀(CA-4)作为微管蛋白聚合抑制剂,是天然提取的抗癌药物。我们以考布他汀和白藜芦醇的二苯乙烯单元作为基本骨架,在其双键桥上引入醛基、羰基、酯基和羧基构建含Michael受体单元的类似物。以人肺癌细胞NCI-H460和人胚胎肺成纤维细胞MRC-5(正常细胞)为模型研究了上述分子的细胞毒活性及机制。发现:(I)部分类似物(如SA-5,SA-16,SA-18,SA-21,SA-22和SA-23)的IC50值达到亚微摩尔级别。部分类似物(SA-15,SA-16,SA-19,SA-21,SA-25和SA-26)能够选择性杀死癌细胞;(Ⅱ)SA-18并不能促进胞内ROS产生,其强毒活性在于抑制微管蛋白二聚并阻滞细胞周期于G2/M期。有趣的是,其结构轻微的改变(仅A环4-OCH3的缺失)导致类似物SA-5呈现完全不同的干预微管蛋白聚合效果—抑制微管蛋白解聚。(5)氨肽酶N(APN,CD-13)是一种与膜结合的、锌离子依赖的金属蛋白酶,在肿瘤转移和血管生成中扮演着重要角色。天然产物姜黄素是一种已知的氨肽酶抑制剂,能与其结合并不可逆地抑制其活性。通过表面等离子共振技术和酶活性实验,测量了一系列姜黄素类似物抑制APN的活性并研究它们的构效关系。发现:(I)姜黄素的活性亚甲基以及苯环上OCH3基团不利于APN的酶抑制活性,而Michael加成受体和能与锌离子螯合的OH基团有利于APN的酶抑制活性;(Ⅱ)据此发现了活性更强的APN酶抑制剂2a、2d和Cur-OH。