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表皮干细胞是皮肤组织特异性干细胞,位于表皮基底层,在维持表皮更新,保持细胞恒定等方面起着重要作用,它也是皮肤及其附属器官发生、修复、改建的关键性源泉。表皮干细胞的增殖与分化不仅为自身基因所预先设置,还受到干细胞“壁龛”（Niche）的调控。Wnt家族是干细胞“壁龛”中重要的组成部分,参与细胞分化、细胞极性、细胞迁移以及细胞增殖等过程。其中,Wnt-1在神经上皮的发育、乳腺癌的发生等上皮性组织的发育与分化的过程中扮演着重要的角色。Wnt-1的表达与皮肤及其附属器的发育在时相上一致:Wnt-1在胚胎时期表达活跃,而成年时多处于相对静止状态;人表皮干细胞于胎龄24周时形成成熟的腺体,而在成年人的创口愈合处,则不能再生为任何腺体,提示表皮及其附属腺体的发育与Wnt-1的表达有很大的关系。基于此,我们在本课题里进行了Wnt-1影响人表皮干细胞分化与增殖的相关研究。在本课题中,我们基于“结构决定功能”的思想,首先以生物信息学的手段和方法,对Wnt-1进行氨基酸序列分析、二级结构预测和理化性质分析,以期获得对Wnt-1的分子水平的了解。在研究Wnt-1对人表皮干细胞的分化与增殖的影响时,我们借助了重组腺病毒基因导入技术将Wnt-1导入到人表皮干细胞内。这是因为Wnt-1是一种不稳定蛋白,在生理条件下极易降解,添加外源性Wnt-1蛋白至细胞培养基中,难以维持其浓度的稳定,且会增加组间误差和组内误差。在人表皮干细胞内表达Wnt-1蛋白前后,我们检测了其增殖能力、标记性分子、基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-7浓度、细胞内Ca2+浓度等多项指标,以研究Wnt-1对人表皮干细胞分化与增殖的影响。第一部分Wnt-1的生物信息学分析一、目的:全面分析Wnt-1蛋白的生物信息学特征二、方法:首先,从NCBI上摘录Wnt家族的全部氨基酸序列,以Phylip和Treeview软件绘制该家族的系统进化树;然后,以ExPASY网站提供的生物信息学分析模块和本地Anthprot生物信息学分析软件对Wnt-1的氨基酸组成成分、等电点、信号肽切割位点、滴定曲线等进行分析;以GOR4、HNN、SOPMA三种方法预测Wnt-1的二级结构;以ExPASY网站相关模块分析Wnt-1的亲水性、极性以及折返系数;最后对这些结果进行比对和分析。三、结果:Wnt家族中,Wnt-4、Wnt-11和Wnt-16单独存在,其他的成员均成对存在;Wnt-1与Wnt-6配对,二者亲缘关系最近。Wnt-1整体略带正电荷;不稳定指数为62.61,为一种不稳定蛋白;整体亲水性指数为-0.347,为一种疏水性蛋白;等电点约在9.0附近;信号肽为一条含27个氨基酸的短肽。GOR4、HNN、SOPMA三种二级结构预测方法均认为Wnt-1的第25～50、112～172、222～238、272～360位区域主要由不规则卷曲结构和伸展结构所构成。亲水性、极性以及折返系数分析结果均提示:第59～69、89～102、150～160、175195、209～220、335342位区域的量化指标高于阈值。四、结论:Wnt-1与Wnt-6配对存在;Wnt-1在生理条件下不稳定;Wnt-1蛋白第150～160和335342两个区域既符合功能结构域的空间构成要素,又符合理化构成要素,最有可能成为其功能结构域。第二部分Wnt-1重组腺病毒的构建一、目的:构建Wnt-1重组腺病毒颗粒二、方法:从其他研究者取得已经构建好的,经测序证实序列无误的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/Wnt-1,将其线性化后在BJ5183细菌中和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1重组,构建成重组腺病毒质粒pAdEasy-1/Wnt-1;使用脂质体转染试剂盒将重组腺病毒质粒pAdEasy-1/Wnt-1导入QBI-293A细胞中,借助该细胞中提供的反式补偿,产生具有普遍感染能力的pAdEasy-1/ Wnt-1重组腺病毒颗粒。最后,对这些病毒颗粒进行大量扩增,以满足下一步实验之用。三、结果:重组腺病毒质粒pAdEasy-1/Wnt-1构建完成后,以Pac I酶切后,可见一条远大于15Kb的明亮条带和一条约4.5Kb的条带,与理论值完全吻合,证明重组质粒构建成功;以该质粒转染QBI-293A细胞后,可观察到绿色荧光蛋白的表达,证明产生了携带Wnt-1重组穿梭质粒的腺病毒颗粒;经大量扩增,最终获得足够的pAdEasy-1/Wnt-1重组腺病毒颗粒。四、结论:Wnt-1重组腺病毒颗粒构建成功。第三部分Wnt-1对人表皮干细胞分化与增殖的影响的研究一、目的:研究Wnt-1对人表皮干细胞分化与增殖的影响二、方法:首先,以IV型胶原快速粘贴法获得人表皮干细胞,并借助重组腺病毒技术将Wnt-1基因导入人表皮干细胞;随后观察绿色荧光蛋白的表达,并以RT-PCR法检测Wnt-1 mRNA在人表皮干细胞中的存在;最后以CASYexcell系统检测人表皮干细胞的增殖能力,以免疫组化法检测角蛋白K5、K6、K7、K8、K10、K18、K19以及CD44、CEA、ER、PR等标记性分子的表达,以ELISA法检测细胞培养基中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-7的浓度,以激光共聚焦技术检测细胞内Ca2+浓度。三、结果:分离获取的人表皮干细胞在接种后第4天进入快速生长期,第8天时到达平台期;Wnt-1基因导入人表皮干细胞后,可观察到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR也检测到了Wnt-1mRNA的存在,故以双重标准证明了Wnt-1基因在人表皮干细胞中的存在与表达;CASYexcell系统检测后发现,人表皮干细胞直径无明显变化,而细胞增殖则明显加强;人表皮干细胞角蛋白K10的表达由阴性变为阳性,K18的表达增强,K19的阳性表达减弱,说明其已经发生了部分转化;培养基中的MMP-2、MMP-7的浓度均显著增高,说明人表皮干细胞获得了降解细胞外基质的分子基础;人表皮干细胞内Ca2+浓度明显升高,使其获得脱离干细胞“壁龛”的趋势。四、结论:Wnt-1具有诱使人表皮干细胞向腺样上皮细胞分化的趋势。