目的骨关节炎是老年人常见的慢性疾病,若早期未经有效治疗,可发展至晚期骨关节炎,并导致患者人群高残疾率。独活寄生汤为治疗膝骨关节炎的经典药方,在临床实践中被广泛应用,并取得良好疗效。既往研究中,很多学者证实NLRP3/NF-κ B信号通路与类风湿性关节炎及痛风性关节炎有关,但膝骨关节炎是否与此通路相关及独活寄生汤能否调节NLRP3/NF-K B信号通路则有待研究。本实验着重基于NLRP3/NF-κB信号通路,从临床、在体动物、离体细胞、药物活性成分分析等多方面初步探讨膝骨关节炎与NLRP3/NF-κ B信号通路的相关性及独活寄生汤能否通过此通路抑制炎症、治疗膝骨关节炎。方法1.临床试验:纳入15例健康成年人为空白组。纳入肝肾亏虚型膝骨关节炎患者60例,随机分为独活寄生汤组及双氯芬酸钠肠溶片组,每组各30例,分别给予相应药物治疗3周。收集治疗前及治疗3周后患者的血清和关节液。ELISA试剂盒测定健康成年人血清中及膝骨关节炎患者血清和关节液中:IL-1 β、IL-6、IL-10、TNF-a、NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB-P65、p-IκBa 各因子水平。2.在体实验:50只健康SD大鼠,随机分为正常组、对照组、双氯芬酸钠组(5mg/kg)、独活寄生汤高剂量组(1g/kg)、独活寄生汤低剂量组(0.5g/kg),除正常组外,其余各组造膝骨关节炎模型,其后分别在治疗后第7、14、21天采用排水法测定各组大鼠足部肿胀体积;治疗后第21天,各组大鼠取眼眶血、膝关节关节液,计数并统计各类白细胞所占百分比;取大鼠膝关节滑膜,HE染色,对大鼠膝关节滑膜病理改变进行评价;大鼠颈动脉取血、膝关节取关节液,ELISA试剂盒检测血清及关节液中IL-6、IL-Iβ、TNF-α水平;取大鼠膝关节滑膜,蛋白印迹法测定大鼠膝关节滑膜中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1 β、p-NF-κ B-P65、NF-κB-P65、p-IκBa、IκBa 蛋白表达水平。3.离体实验:80只健康SD大鼠,随机分为4组:空白组、独活寄生汤高剂量组(1g/kg)、独活寄生汤低剂量组(0.5g/kg)、双氯芬酸钠组(5mg/kg),制备含药血清。予原代软骨细胞培养并分组:正常组(10%空白组大鼠血清)、对照组(脂多糖8 μg/mL+10%空白组大鼠血清)、含药血清组1(脂多糖8 μ g/mL+10%双氯芬酸钠含药血清)、含药血清组2(脂多糖8 μg/mL+10%独活寄生汤0.5g/kg含药血清)、含药血清组3(脂多糖8μg/mL+10%独活寄生汤1g/kg含药血清)。含药血清刺激24小时。MTT检测各组细胞活力;检测细胞上清液中SOD活性与MDA含量;ELISA试剂盒测定细胞上清液中IL-6、IL-1 β、TNF-α的含量;蛋白印迹法测定软骨细胞内NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κB-P65、NF-κB-P65、p-Iκ Ba、IκBa 蛋白表达水平。4.药物活性成分分析:结合相关参考资料,筛选出了独活寄生汤具有代表性的4个主要成分,分别为甘草酸、茯苓酸、芍药苷和龙胆碱。MTT检测不同有效成分作用于脂多糖诱导后的软骨细胞的细胞活力;同在体实验复制膝骨关节炎大鼠模型,分组为:正常组、对照组、双氯芬酸钠组(5mg/kg)、龙胆碱低(20mg/kg)、高(40mg/kg)剂量组;分别在治疗后第7、14、21天采用排水法测定各组大鼠足部肿胀体积;治疗后第21天,取大鼠膝关节滑膜,HE染色,对大鼠膝关节滑膜病理改变进行评价;大鼠颈动脉取血、膝关节取关节液,ELISA试剂盒检测血清及关节液中IL-6、IL-1 β、TNF-α水平。结果1.临床试验:与健康成年人相比,肝肾亏虚型膝骨关节炎患者血清中:IL-1β、IL-6、TNF-a、NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB-P65、p-IκBa 水平显著升高(P<0.01),IL-10水平显著降低(P<0.01)。膝骨关节炎患者治疗前后血清及关节液中 IL-1β、IL-6、TNF-a、NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB-P65、p-IKBa因子的水平显著降低(P<0.01),IL-10水平显著升高(P<0.01)。2.在体实验:与正常组比较,对照组大鼠足部肿胀体积显著增加(P<0.01),独活寄生汤组大鼠足部肿胀程度逐渐减轻,治疗2周及3周后,独活寄生汤组大鼠足部肿胀体积与对照组相比显著降低(P<0.01)。与正常组比较,膝骨关节炎模型大鼠血液中淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分比显著性升高(P<0.01),给予独活寄生汤或双氯芬酸钠治疗后,血液中的相应细胞百分比显著降低(P<0.01)。与正常组比较,膝骨关节炎模型大鼠关节液中白细胞(P<0.01)、淋巴细胞(P<0.01)、中性粒细胞(P<0.01)、嗜酸性粒细胞(P<0.01)百分比显著升高。独活寄生汤给药或双氯芬酸钠治疗后,关节液中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分比显著降低(P<0.01)。与正常组相比,对照组大鼠膝关节滑膜表层细胞增生,可见显著炎性细胞浸润,滑膜血管充血、水肿,细胞显著增生。给予独活寄生汤或双氯芬酸钠治疗后,较之对照组,膝关节滑膜细胞增生减少,相应的滑膜充血肿胀程度也有所减轻,炎性细胞的浸润与血管增生减轻,双氯芬酸钠组疗效更显著。与正常组相比,膝骨关节炎大鼠血清及关节液中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平显著升高(P<0.01)。给予独活寄生汤和阳性对照药双氯芬酸钠肠溶片治疗后,相应指标的水平显著降低(P<0.01)。与正常组比较,膝骨关节炎大鼠滑膜内NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1 β、p-NF-κ B-P65、p-IκBa 蛋白表达水平显著升高(P<0.01),p-NF-κB-P65/NF-κB-P65、p-IκBa/IκBa的值显著升高(P<0.01)。独活寄生汤给药组及双氯芬酸钠组均能显著降低膝骨关节炎大鼠滑膜NLRP3/NF-κB信号通路相关蛋白表达水平(P<0.01)。3.离体实验:脂多糖诱导后对照组软骨细胞细胞存活率显著降低(P<0.01),各含药血清组均显著提高软骨细胞细胞存活率(P<0.01)。脂多糖诱导对照组软骨细胞上清液中SOD活性显著降低(P<0.01),MDA含量显著升高(P<0.01),各含药血清组均显著提高脂多糖诱导后的软骨细胞上清液中SOD活性并降低MDA的含量(P<0.01)。脂多糖诱导后对照组软骨细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平显著升高(P<0.01),各含药血清组均显著降低其相应指标的含量(P<0.01)。与正常组细胞相比,脂多糖诱导后的软骨细胞内NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κB-P65、p-IκBa 蛋白表达水平显著升高(P<0.01),p-NF-κB-P65/NF-κB-P65、p-IκBa/IκBa 的值显著升高(P<0.01),各含药血清组NLRP3/NF-KB信号通路相关蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。4.药物活性成分分析:与正常组相比,脂多糖诱导后对照组软骨细胞细胞存活率显著降低。给予独活寄生汤四个活性成分:甘草酸、茯苓酸、芍药苷和龙胆碱后,各组细胞活性显著提高(P<0.01),其中龙胆碱促进细胞活性的作用最强。与正常组比较,对照组大鼠足部肿胀体积显著增加(P<0.01)。龙胆碱组大鼠足部肿胀程度逐渐减轻,治疗2周及3周后,龙胆碱组大鼠足部肿胀体积与对照组相比显著降低(P<0.01)。与正常组相比,对照组大鼠膝关节滑膜表层细胞增生,可见显著炎性细胞浸润,滑膜血管充血、水肿,细胞显著增生。给予龙胆碱或双氯芬酸钠治疗后,较之对照组,膝关节滑膜肿胀、充血程度及滑膜细胞增生减轻,双氯芬酸钠组效果更显著。与正常组相比,膝骨关节炎大鼠血清及关节液中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平显著升高(P<0.01)。给予龙胆碱和阳性对照药双氯芬酸钠肠溶片治疗后,相应指标水平显著降低(P<0.01)。结论1.肝肾亏虚型膝骨关节炎患者体内NLRP3/NF-κ B信号通路被显著激活,血清及关节液中的相关因子,如 IL-1β、IL-6、TNF-a、NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB-P65、p-IκBa的水平显著升高,IL-10水平显著降低。独活寄生汤可以显著抑制NLRP3/NF-κ B信号通路,调节膝骨关节炎患者体内NLRP3/NF-κ B信号通路相关因子的水平。2.独活寄生汤对膝骨关节炎大鼠有较好的治疗效果,减轻了膝骨关节炎大鼠的足部肿胀,降低了模型大鼠血液和关节液内的炎症细胞百分比及血清和关节液内的IL-6、IL-1β、TNF-α水平,减弱了关节滑膜的炎症,提示独活寄生汤可能通过抑制NLRP3/NF-κB信号通路相关因子的蛋白表达水平,抑制了该通路的炎症作用,从而减轻膝骨关节炎大鼠的症状。3.独活寄生汤对脂多糖诱导的软骨细胞有较好的保护作用,独活寄生汤通过抑制炎症的发生,发挥了对细胞的保护作用。4.独活寄生汤的主要活性成分甘草酸、茯苓酸、芍药苷和龙胆碱对脂多糖诱导的软骨细胞有保护作用。在体实验中,龙胆碱对膝骨关节炎大鼠有炎症抑制作用。其对炎症的抑制作用与独活寄生汤相似。