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目的：我们通过对前期的质谱检测结果进行搜库、统计分析,首次在真核生物中发现了丝氨酸位点存在乙酰化修饰现象。而细胞周期依赖性激酶8(CDK8)是丝氨酸乙酰化重要的目标蛋白之一。我们试图通过本次试验确认蛋白激酶CDK8丝氨酸位点存在乙酰化修饰,并且进一步探讨蛋白激酶CDK8丝氨酸乙酰化修饰对其磷酸化下游底物CTD结构域的影响。方法：1.根据Open Resarch结果,确认真核细胞中内源性蛋白激酶CDK8丝氨酸位点的乙酰化：提取293T细胞总蛋白,IP纯化内源性CDK8,通过液-质连用质谱技术(LC-MS/MS)检测所有氨基酸位点乙酰化修饰位点,了解蛋白激酶CDK8丝氨酸乙酰化修饰在功能区的分布状态及比例。2.检测外源性蛋白激酶CDK8在原核细菌中的丝氨酸的乙酰化修饰：构建PQE30-His-CDK8重组质粒,通过IPTG诱导剂使外源性CDK8质粒在原核细菌BL21中表达,Ni柱纯化外源性CDK8, LC-MS/MS技术检测该蛋白丝氨酸乙酰化修饰情况。3.检测外源性蛋白激酶CDK8在真核细胞中的丝氨酸的乙酰化修饰：构建PCDNA3.0-Flag-CDK8重组质粒,通过转染技术把质粒导入293T细胞进行表达,免疫沉淀技术纯化外源性CDK8, LC-MS/MS技术检测该蛋白丝氨酸乙酰化修饰。4.检测蛋白激酶CDK8的丝氨酸乙酰化修饰对其磷酸化功能的影响：①构建PCDNA3.0-Flag-CDK8突变质粒[突变位点是把蛋白激酶CDK810、11位上的丝氨酸分别突变成丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C),通过转染把质粒导入293T细胞表达,免疫沉淀技术纯化外源性CDK8。②构建PQE30-His-CTD质粒,将表达的CTD蛋白与突变的蛋白激酶CDK837℃孵育一小时,LC-MS/MS技术检测CTD蛋白的磷酸化修饰情况。鉴定蛋白激酶CDK8激酶10、11位丝氨酸乙酰化修饰对蛋白激酶CDK8激酶磷酸化功能的影响。结果1.质谱检测发现293T中内源性蛋白激酶CDK8发现大量丝氨酸位点都广泛存在乙酰化修饰,并且丝氨酸乙酰化修饰主要集中在功能域和亚基间相互作用结构域。2.质谱检测Ni柱纯化后的外源性蛋白激酶CDK8,发现该外源蛋白激酶CDK8大量丝氨酸位点存在乙酰化修饰。3.质谱检测IP纯化后的外源性蛋白激酶CDK8,发现大量丝氨酸位点也存在乙酰化修饰,且修饰比例与原核表达的CDK8有差别。4.蛋白激酶CDK8第10、11位的丝氨酸位点的乙酰化影响该蛋白的磷酸化功能。结论1.证实了真核细胞或原核细菌中蛋白激酶CDK8丝氨酸都广泛存在乙酰化修。许多乙酰化修饰位点已被证实可以发生磷酸化修饰,这揭示了丝氨酸位点的乙酰化和磷酸化修饰可能存在竞争关系。2.CDK8第10、11位丝氨酸乙酰化和磷酸化修饰的动态平衡会影响该蛋白对下游底物CTD结构域的磷酸化功能。