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目的慢性应激(心理压力)作为心血管疾病的重要危险因素，严重危害人类的身心健康。尤其是长期暴露于慢性应激状态下，血栓性CCVD的发生率逐年攀升，日益被受重视。动脉血栓形成是局部凝血系统功能亢进的一种病理生理反应，主要与血管性血友病因子(vWF)/含Ⅰ型血小板反应蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS13)失衡密切相关。另外，二肽基肽酶-4(DPP-4)是一中丝氨酸蛋白酶，主要参与代谢性/炎症性疾病的发生、发展。最近，我们观察到慢性应激可增加血浆DPP-4活性水平并引起一系列病理生理变化，如动脉粥样硬化、糖尿病、血栓前状态等，但是DPP-4在慢性应激性血栓形成中的作用机制尚未明确。因此，本研究通过建立慢性制动应激模型和FeCl3诱导的血栓模型，探讨DPP-4在慢性应激相关血栓形成中的作用机制。聚焦探讨慢性应激负荷下激活的DPP-4，通过参与氧化应激/炎症反应，使PAI-1增多、vWF/ADAMTS13失衡，从而促进动脉内皮细胞的损伤及动脉血栓形成的作用机制，为今后应激相关血栓性CCVD的防治工作提供新的治疗靶点及实验依据。
方法
实验1:观察慢性制动束缚应激对小鼠颈动脉血栓形成的影响
将选取6周龄大小雄性野生型小鼠，随机分为应激血栓模型组(Stress组，n=12)与非应激血栓模型组(Non-stress组，n=12)。去应激饲养2周后(8周龄)，建立慢性制动束缚应激模型。Stress组小鼠放入固定应激模型设备，禁止进食和饮水，4小时/天，一次/日，连续14天。Non-stress组小鼠作为对照组，未进行任何处理。慢性制动束缚应激模型第15天，腹腔内注射戊巴比妥进行麻醉后，两组均建立FeCl3诱导的左颈总动脉血栓形成模型(15min)。两组小鼠均采集心脏血液、腹股沟区皮下脂肪和颈动脉组织进行以下实验:①观察小鼠体重变化;②分析颈动脉内形成血栓重量和长度;③进行颈动脉HE染色和CD31免疫组化染色，观察慢性应激对颈动脉血栓形成面积的影响及颈动脉病变区内皮损伤程度;④化学发光法测定血浆中DPP-4活性水平;⑤酶联免疫吸附试验测定血浆中PAI-1、vWF和ADAMTS13的水平;⑥应用实时PCR技术对颈动脉组织和脂肪组织的目标基因PAI-1、ADAMTS13、NADPH氧化酶组分(p22phox、gp91phox、p47phox和p67phox)、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、TNF-α、IL-1β、基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)、MMP组织抑制剂(TIMP-1、TIMP-2)，组织蛋白酶(Cats、Catk)等进行定量分析;⑦免疫蛋白印迹法测定颈动脉组织目标蛋白(gp91phox、eNOS、Catalase、SOD-1、SOD-2)表达;
实验2:探讨DPP-4抑制剂对慢性应激小鼠由FeCl3诱导血柱形成的影响
将小鼠随机分为应激血栓模型组(Stress组)与应激血栓模型+阿格列汀组(S-Ana组)。两组均建立慢性制动束缚应激模型(方法同实验1)同时，S-Ana组小鼠每天灌胃阿格列汀(DPP-4抑制剂)30mg/kg/次，两次/日，持续14天，Stress组小鼠作为对照组用蒸馏水处理。应激负荷第15天，两组小鼠均建立由FeCl3诱导颈动脉血栓形成模型，进行实验(方法同实验1)。
实验3:观察H2O2诱导氧化应激对HUVECs的损伤作用。
将HUVECs接种到6孔板培养皿中培养24小时。无血清EBM-2中过夜后，不同浓度H2O2(0μM、200μM和400μM)诱导氧化应激，RT-PCR技术检测eNOS、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1、MMP-2、MMP-9、gp91phox、p22phox等目标基因表达水平。
实验4:观察DPP-4抑制剂对H2O2诱导氧化应激的HUVECs保护作用。
将以三个不同浓度阿格列(0μM、10μM和30μM)预处理HUVECs30分钟，再用400μMH2O2处理24小时，使用RT-PCR技术检测eNOS、VCAM-1、ICAM-1、CatK、CatS、MCP-1、gp91phox和p22phox等基因表达水平。
结果
1、慢性制动应激促进小鼠颈动脉由FeCl3诱导血栓的形成
①Stress组小鼠的体重低于Non-stress组小鼠。②与Non-stress组相Stress组小鼠颈动脉血栓的重量显著增高，并且血栓的长度明显增加。③HE染色显示Stress组小鼠颈动脉血栓面积明显增加，在血栓形成颈动脉病变区域CD31+内皮细胞数量显著减少。④Stress组小鼠血浆DPP-4活性水平显著增高，ELISA结果显示Stress组小鼠血浆PAI-1、vWF水平显著增高，而ADAMTS13水平显著降低。⑤PCR结果显示Stress组小鼠FeCl3诱导血栓形成部位的颈动脉内目标基因包括ICAM-1、VCAM-1和MCP-1、p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox水平明显增高，蛋白水解相关基因包括CatK、CatS、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2和PAI-1mRNA水平显著增高，而eNOS的mRNA表达水平显著降低;Stress组小鼠皮下脂肪组织中PAI-1和氧化应激相关基因p22phox、gp91phox及炎症相关基因包括TNF-α、IL-1β、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的mRNA表达水平显著增加。⑥免疫蛋白印迹结果显示Stress组颈动脉中gp91phox蛋白表达显著增多，eNOS、Catalase、SOD-1、SOD-2蛋白表达显著减少。⑦Stress组小鼠血液白细胞、中性粒细胞和血小板计数明显增多。
2、DPP-4抑制剂可改善慢性应激小鼠颈动脉由FeCl3诱导的血栓形成
①DPP-4抑制剂阿格列汀预处理可显著降低S-Ana组小鼠血栓重量，并血栓长度明显短于Stress组小鼠。②S-Aa组小鼠颈动脉血栓形成病变区域内CD31+内皮细胞数量显著多于对照组，并颈动脉血栓形成面积明显减小，同时S-Ana组小鼠血液白细胞数量显著降低，但S-Ana组小鼠的体重没有明显变化。③ELISA结果显示阿格列汀明显降低S-Ana组小鼠血浆DPP-4活性和PAI-1、vWF水平，并提高ADAMTS13水平。④阿格列汀预处理后S-Ana组小鼠颈动脉组织ICAM-1、VCAM-1和MCP-1、P22phox、P47phox、p67phox和gp91phox的mRNA表达显著降低，同时CatS、Catk、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2和PAI-1mRNA表达显著降低，而eNOSmRNA表达显著增高。⑤阿格列汀明显降低S-Ana组小鼠颈动脉gp91phox蛋白表达，并增加eNOS、Catalase、SOD-1、SOD-2蛋白表达。⑥S-Ana组小鼠皮下脂肪组织PAI-1、P22phox、gp91phox、TNF-α、IL-1β、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达水显著降低平。
3、H2O2诱导氧化应激对HUVECs的损伤作用及DPP-4抑制剂对氧化应激的保护作用
H2O2以剂量依赖性降低HUVECs中ADAMTS13和eNOS的mRNA表达水平。相反，以剂量依赖性增加炎症趋化因子(ICAM-1、VCAM-1和MCP-1)和蛋白水解酶(MMP-2、MMP-9、CatS、Catk)的mRNA表达水平。阿格列汀明显改善H2O2对HUVECs的损伤作用，以剂量依赖性提高ADAMTS13和eNOSmRNA表达，同时显著抑制了ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、CatS、Catk的mRNA表达水平。
结论
1.慢性应激负荷下血浆DPP-4被激活，介导颈动脉组织内皮氧化应激和炎症反应及内皮细胞损伤，使蛋白水解增多和vWF/ADAMTS13失衡，从而促进血栓形成。
2.慢性应激所致DPP-4的激活，介导皮下脂肪组织氧化应激和炎症反应，使脂肪组织释放PAI-1，从而促进血栓形成。
3.阿格列汀可抑制慢性应激小鼠DPP-4活性，通过抑制颈动脉组织和脂肪组织的氧化应激和炎症反应，减轻颈动脉内皮损伤、改善vWF/ADAMTS13失衡及PAI-1高表达，从而抑制应激性血栓的形成。
4、阿格列汀可改善H2O2诱导氧化应激对HUVECs的损伤作用
提示DPP-4可成为应激相关血栓性心血管事件的新的生物标志物及防治慢性心理应激相关血栓性心血管疾病的新的治疗靶点。
方法
实验1:观察慢性制动束缚应激对小鼠颈动脉血栓形成的影响
将选取6周龄大小雄性野生型小鼠，随机分为应激血栓模型组(Stress组，n=12)与非应激血栓模型组(Non-stress组，n=12)。去应激饲养2周后(8周龄)，建立慢性制动束缚应激模型。Stress组小鼠放入固定应激模型设备，禁止进食和饮水，4小时/天，一次/日，连续14天。Non-stress组小鼠作为对照组，未进行任何处理。慢性制动束缚应激模型第15天，腹腔内注射戊巴比妥进行麻醉后，两组均建立FeCl3诱导的左颈总动脉血栓形成模型(15min)。两组小鼠均采集心脏血液、腹股沟区皮下脂肪和颈动脉组织进行以下实验:①观察小鼠体重变化;②分析颈动脉内形成血栓重量和长度;③进行颈动脉HE染色和CD31免疫组化染色，观察慢性应激对颈动脉血栓形成面积的影响及颈动脉病变区内皮损伤程度;④化学发光法测定血浆中DPP-4活性水平;⑤酶联免疫吸附试验测定血浆中PAI-1、vWF和ADAMTS13的水平;⑥应用实时PCR技术对颈动脉组织和脂肪组织的目标基因PAI-1、ADAMTS13、NADPH氧化酶组分(p22phox、gp91phox、p47phox和p67phox)、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、TNF-α、IL-1β、基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)、MMP组织抑制剂(TIMP-1、TIMP-2)，组织蛋白酶(Cats、Catk)等进行定量分析;⑦免疫蛋白印迹法测定颈动脉组织目标蛋白(gp91phox、eNOS、Catalase、SOD-1、SOD-2)表达;
实验2:探讨DPP-4抑制剂对慢性应激小鼠由FeCl3诱导血柱形成的影响
将小鼠随机分为应激血栓模型组(Stress组)与应激血栓模型+阿格列汀组(S-Ana组)。两组均建立慢性制动束缚应激模型(方法同实验1)同时，S-Ana组小鼠每天灌胃阿格列汀(DPP-4抑制剂)30mg/kg/次，两次/日，持续14天，Stress组小鼠作为对照组用蒸馏水处理。应激负荷第15天，两组小鼠均建立由FeCl3诱导颈动脉血栓形成模型，进行实验(方法同实验1)。
实验3:观察H2O2诱导氧化应激对HUVECs的损伤作用。
将HUVECs接种到6孔板培养皿中培养24小时。无血清EBM-2中过夜后，不同浓度H2O2(0μM、200μM和400μM)诱导氧化应激，RT-PCR技术检测eNOS、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1、MMP-2、MMP-9、gp91phox、p22phox等目标基因表达水平。
实验4:观察DPP-4抑制剂对H2O2诱导氧化应激的HUVECs保护作用。
将以三个不同浓度阿格列(0μM、10μM和30μM)预处理HUVECs30分钟，再用400μMH2O2处理24小时，使用RT-PCR技术检测eNOS、VCAM-1、ICAM-1、CatK、CatS、MCP-1、gp91phox和p22phox等基因表达水平。
结果
1、慢性制动应激促进小鼠颈动脉由FeCl3诱导血栓的形成
①Stress组小鼠的体重低于Non-stress组小鼠。②与Non-stress组相Stress组小鼠颈动脉血栓的重量显著增高，并且血栓的长度明显增加。③HE染色显示Stress组小鼠颈动脉血栓面积明显增加，在血栓形成颈动脉病变区域CD31+内皮细胞数量显著减少。④Stress组小鼠血浆DPP-4活性水平显著增高，ELISA结果显示Stress组小鼠血浆PAI-1、vWF水平显著增高，而ADAMTS13水平显著降低。⑤PCR结果显示Stress组小鼠FeCl3诱导血栓形成部位的颈动脉内目标基因包括ICAM-1、VCAM-1和MCP-1、p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox水平明显增高，蛋白水解相关基因包括CatK、CatS、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2和PAI-1mRNA水平显著增高，而eNOS的mRNA表达水平显著降低;Stress组小鼠皮下脂肪组织中PAI-1和氧化应激相关基因p22phox、gp91phox及炎症相关基因包括TNF-α、IL-1β、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的mRNA表达水平显著增加。⑥免疫蛋白印迹结果显示Stress组颈动脉中gp91phox蛋白表达显著增多，eNOS、Catalase、SOD-1、SOD-2蛋白表达显著减少。⑦Stress组小鼠血液白细胞、中性粒细胞和血小板计数明显增多。
2、DPP-4抑制剂可改善慢性应激小鼠颈动脉由FeCl3诱导的血栓形成
①DPP-4抑制剂阿格列汀预处理可显著降低S-Ana组小鼠血栓重量，并血栓长度明显短于Stress组小鼠。②S-Aa组小鼠颈动脉血栓形成病变区域内CD31+内皮细胞数量显著多于对照组，并颈动脉血栓形成面积明显减小，同时S-Ana组小鼠血液白细胞数量显著降低，但S-Ana组小鼠的体重没有明显变化。③ELISA结果显示阿格列汀明显降低S-Ana组小鼠血浆DPP-4活性和PAI-1、vWF水平，并提高ADAMTS13水平。④阿格列汀预处理后S-Ana组小鼠颈动脉组织ICAM-1、VCAM-1和MCP-1、P22phox、P47phox、p67phox和gp91phox的mRNA表达显著降低，同时CatS、Catk、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2和PAI-1mRNA表达显著降低，而eNOSmRNA表达显著增高。⑤阿格列汀明显降低S-Ana组小鼠颈动脉gp91phox蛋白表达，并增加eNOS、Catalase、SOD-1、SOD-2蛋白表达。⑥S-Ana组小鼠皮下脂肪组织PAI-1、P22phox、gp91phox、TNF-α、IL-1β、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达水显著降低平。
3、H2O2诱导氧化应激对HUVECs的损伤作用及DPP-4抑制剂对氧化应激的保护作用
H2O2以剂量依赖性降低HUVECs中ADAMTS13和eNOS的mRNA表达水平。相反，以剂量依赖性增加炎症趋化因子(ICAM-1、VCAM-1和MCP-1)和蛋白水解酶(MMP-2、MMP-9、CatS、Catk)的mRNA表达水平。阿格列汀明显改善H2O2对HUVECs的损伤作用，以剂量依赖性提高ADAMTS13和eNOSmRNA表达，同时显著抑制了ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、CatS、Catk的mRNA表达水平。
结论
1.慢性应激负荷下血浆DPP-4被激活，介导颈动脉组织内皮氧化应激和炎症反应及内皮细胞损伤，使蛋白水解增多和vWF/ADAMTS13失衡，从而促进血栓形成。
2.慢性应激所致DPP-4的激活，介导皮下脂肪组织氧化应激和炎症反应，使脂肪组织释放PAI-1，从而促进血栓形成。
3.阿格列汀可抑制慢性应激小鼠DPP-4活性，通过抑制颈动脉组织和脂肪组织的氧化应激和炎症反应，减轻颈动脉内皮损伤、改善vWF/ADAMTS13失衡及PAI-1高表达，从而抑制应激性血栓的形成。
4、阿格列汀可改善H2O2诱导氧化应激对HUVECs的损伤作用
提示DPP-4可成为应激相关血栓性心血管事件的新的生物标志物及防治慢性心理应激相关血栓性心血管疾病的新的治疗靶点。