研究背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)作为心脑血管疾病的病理基础,目前已经成为威胁人类尤其是中老年人健康的最重要的疾病,由此导致的心脑血管意外发生率和死亡率极高,即使是在幸免的存活者中也仍然存在极高的致残率。动脉粥样硬化所涉及的致病因素极多,且其病理过程复杂,尽管此前已有诸多学说试图解释其发病机理,但其具体的发病及进展机制至今仍未明确。诸多研究已经证实,动脉粥样硬化所致的临床急性缺血事件更多与斑块的稳定性密切相关,而非动脉管腔的狭窄程度。不稳定斑块破裂出血,并继发导致血栓形成已经成为临床急性心血管事件的主要病理机制。由此引入了易损斑块(Vulnerable Plaque)的概念,其作为具有极强破裂倾向的斑块,特点包括纤维帽在各种因素下逐渐变薄、坏死脂质核心逐渐增大、以巨噬细胞浸润为特征的斑块内活性炎症状态、平滑肌细胞逐渐减少以及胶原含量逐渐减少。并以此为依据引入易损指数,易损指数可以定量地评估斑块易损性,其定义为：易损指数＝(脂质占斑块面积百分比+巨噬细胞占斑块面积百分比)／(胶原占斑块面积百分比+平滑肌细胞占斑块面积百分比)。因此,探寻影响AS斑块稳定性的各种危险因素,并寻求能有效地稳定易损斑块的干预靶点,积极避免斑块破裂及继发的心脑血管事件成为近年来的研究热点。既往研究证实血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A, SAA)家族由SAA1、 SAA2、SAA3及SAA4四个家族成员构成。作为家族最主要组成成分的SAA1是SAA家族中表达最广泛、活性最强、反应最敏感的亚型。虽然在常态下SAA1表达水平较低,但在急性期状态下其血清浓度在极短时间内升高1000倍。血清SAA1主要由肝细胞合成并分泌,而其他组织细胞同样具有局部分泌SAA1的功能。在AS斑块内,SAA1可以由巨噬细胞合成分泌。此外,SAA在细胞膜上可能存在的受体包括：B型清道夫受体1(Scavenger receptor class B member1, SR-B I)、甲酰肽样受体1(formyl peptide receptor like-1, FPRL1)、Toll样受体(toll-like receptor, TLR)等。在不同细胞上SAA根据结合受体的类型,可能发挥不同的生物学作用。近年来,随着对SAA1的深入研究,人们发现SAA1与AS之间存在密切的联系。SAA1可在AS斑块进展的全程出现,并且血清SAA1的浓度与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生成显著正相关。最新相关临床研究则发现,血清SAA1的水平可以作为一个独立的预测因素评估心血管急性事件的发生。这提示我们,SAA1对AS病程所发挥的作用可能不仅仅局限于斑块的形成阶段,而是通过某种作用机制进一步影响AS斑块的稳定性,并最终影响心血管急性事件的发生。影响AS斑块稳定性的因素是多方面的,涉及到巨噬细胞浸润、脂质沉积、平滑肌增殖迁移,细胞外基质降解及内皮细胞功能障碍等诸多环节。此前的研究一方面显示,SAA1可增加脂质沉积,加速脂核形成,通过促进单核巨噬细胞的趋化和粘附,增加了AS斑块中的炎症细胞浸润,这表明SAA1具有减弱斑块稳定性的作用；而另一些研究则表明SAA能增加平滑肌细胞的迁移和增殖,同时能刺激细胞外基质的表达增加,这又从另外方面表明SAA1具有增加斑块稳定性的作用。由此可见,SAA对AS斑块稳定性的影响是多方面的,甚至可能是双向的,基于以往的研究无法推断SAA对AS斑块稳定性的影响,目前尚存在以下问题亟待探讨和解决：①SAA1对动脉粥样硬化斑块稳定性的具体影响；②SAA1对动脉粥样硬化斑块内成分的影响；③SAA1发挥作用的信号通路。研究目的：1.通过转染SAA1慢病毒,明确SAA1高表达对AS斑块稳定性的影响；2.探讨SAA1慢病毒转染对斑块内脂质、巨噬细胞、平滑肌细胞及胶原的影响；3.通过体内外实验明确SAA1对胶原表达的影响及其相关信号通路。研究方法：1.SAA1高表达慢病毒的构建获取目的基因后,经RT-PCR扩增后将目的基因片段与慢病毒载体plenti6.3-MSC-IRES-EGFP连接,构建成plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP,并经转化、包装后测定慢病毒的滴度,用于实验。2.动物饲养及建模将100只6-8周龄的雄性ApoE-/-小鼠适应性喂养1周,给予颈动脉套管。继续高脂喂养8周后,随机将剩余的95只ApoE-/-小鼠分为4组:Control组(n=23)、lenti-null组(n=25、low-lenti-SAA1组(n=23)及high-lenti-SAA1组(n=24)。Lenti-null组给予1x107TU空慢病毒载体,low-lenti-SAA1组给予1×107TUSAA1高表达慢病毒,high-lenti-SAA1组1×109TUSAA1高表达慢病毒,control组给予相同体积生理盐水。继续高脂喂养4周后,小鼠空腹12小时,称体重,以0.8%戊巴比妥麻醉,打开胸腔,心脏取血,置于-80度冰箱保存,以备后续检测。以生理盐水灌洗心脏和主动脉,冲洗出残余血液。部分动物继以4%多聚甲醛固定直至肝脏变硬,收集小鼠套管近端的颈动脉,以4%多聚甲醛浸泡24小时。其余部分动物的颈动脉标本置于-80度冰箱保存。3.酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)以ELISA法检测血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三脂及TNF-α、IL-6的浓度。4.颈动脉油红O染色对小鼠颈动脉进行5μm连续切片,每10张取1张用于油红O染色,病变的严重程度用斑块占颈动脉斑块面积的百分比来表示。5.组织免疫组织化学染色对冰冻切片行SAA1、α-SMC actin、MOMA-2、胶原I、胶原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8免疫组化染色观察SAA高表达对斑块SAA、α-SMC actin、 MOMA-2、胶原I、胶原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8的影响。6. Western blot检测定量称取冻存组织,或收集细胞,提取蛋白,采用western blot法,以GAPDH为内参检测SAA1、胶原I、胶原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8、MMP2、MMP9的表达；以相应非磷酸化状态为内参检测p-p38、ERK1/2、JNK、Smad2、Smad3的表达。7.实时定量PCR (real-time PCR)检测定量称取冻存组织,Trizol法提取总RNA,经过逆转录后以18S为内参检测SAA1的表达,以确定SAA1高表达慢病毒的转染效果。8.免疫荧光染色重组SAA1蛋白刺激平滑肌细胞后,免疫荧光法检测胶原I、胶原III、MMP1和MMP8的表达。9.统计学分析所有数值均以均数±标准差表示。对数据进行正态分布检验,正态分布的计数资料应用Student t检验,多组采用方差分析(ANOVA),非正态分布的资料行Mann-Whitney检验。设P<0.05有统计学差异。研究结果：1.各组小鼠的一般情况Control组(n=23)、lenti-null组(n=25)、low-lenti-SAA1组(n=23)及high-lenti-SAA1组(n=24) ApoE-/-小鼠的体重及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平浓度无差异(P>0.05)。表明SAA1高表达慢病毒的局部转染,没有影响小鼠体内整体的脂质代谢。2. plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP慢病毒转染对血清SAA1及其他炎症因子表达的影响Control组、lenti-null组、1ow-lenti-SAA1组的血清SAA1表达几乎没有变化,high-lenti-SAA1组的血清SAA1表达略高于前三组,但尚未达到统计学差异(P>0.05)；这四个组的炎症因子TNF-α、IL-6在血清中的分泌表达也未达到统计学差异(P>0.05)。表明慢病毒的局部转染,没有引起小鼠体内显著的炎症反应。3. plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP;慢病毒转染后SAA1在颈动脉斑块内表达的检测SAA1的免疫组化结果显示, control组和lenti-null组的阳性染色面积无差异(P>0.05), low-lenti-SAA1组和high-lenti-SAA1组的SAA1阳性染色区域显著高于lenti-null组及control组(P<0.05)。Western blot结果显示,control组和lenti-null组的SAA1表达量无差异(P>0.05), low-lenti-SAA1组和high-lenti-SAA1组的SAA1表达量显著高于lenti-null组及control组(P<0.05)。Real-time PCR的检测结果与蛋白检测结果一致。这一结果表明SAA1高表达慢病毒成功达到了使SAA1在斑块内表达的目的。4. SAA1高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内脂质聚集的影响小鼠颈动脉斑块冰冻切片油红O染色显示,lenti-null组及low-lenti-SAA1组与control组相比,脂质含量未见显著改变；high-lenti-SAA1组与control组相比,脂质含量增加(P<0.05)；同时,high-lenti-SAA1组与low-lenti-SAA1组相比,脂质含量也显著增加(P<0.05)。这一结果表明,SAA1低浓度表达不能显著改变斑块内脂质沉积,而高浓度表达则显著促进脂质在斑块内的聚集。5.SAA1高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内巨噬细胞的调节作用对小鼠颈动脉斑块冰冻切片进行巨噬细胞染色,可以发现与control组相比,lenti-null组巨噬细胞比例未见显著改变(P>0.05); low-lenti-SAA1组巨噬细胞的比例显著增加(P<0.05); high-lenti-SAA1组巨噬细胞的比例显著增加(P<0.01)；high-lenti-SAA1组与low-lenti-SAA1组相比,巨噬细胞占斑块面积的比例虽然增加,但未达到统计学差异(P>0.05)。这一结果表明,两个浓度梯度的SAA1高表达慢病毒转染均能显著增加颈动脉斑块内巨噬细胞的聚集。6.SAA1高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内平滑肌细胞的影响对小鼠颈动脉斑块冰冻切片进行平滑肌细胞染色,四组之间的平滑肌细胞聚集未见显著改变,尽管两个浓度梯度的SAA1高表达慢病毒转染有轻微地增加颈动脉斑块内平滑肌细胞聚集的趋势,但未达到统计学差异。这一结果表明,SAA1高表达慢病毒转染不能改变斑块内平滑肌细胞的聚集。7.SAA1高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内胶原表达的影响通过对小鼠颈动脉斑块冰冻切片进行masson染色,发现与control组相比,lenti-null组胶原未见显著改变(P>0.05); low-lenti-SAA1组胶原的比例显著增加(P<0.01); high-lenti-SAA1组胶原的比例未见显著增加(P>0.05); high-lenti-SAA1组与low-lenti-SAA1组相比,胶原的比例显著减少,达到统计学差异(P<0.05)。这一结果表明,低浓度的SAA1高表达慢病毒转染能显著增加颈动脉斑块内胶原的聚集,但增加SAA1高表达慢病毒的浓度则使这种促进胶原增加的作用消失。8.SAA1高表达慢病毒转染对颈动脉斑块易损性的影响结果显示,与control组相比,lenti-null组易损指数未见显著改变(P>0.05)；low-lenti-SAA1组易损指数显著减低(P<0.05); high-lenti-SAA1组易损指数显著增加(P<0.05); high-lenti-SAA1组与low-lenti-SAA1组相比,易损指数显著增加达到统计学差异(P>0.05)。这一结果表明,低浓度的SAA1高表达慢病毒转染能显著降低斑块的易损性,但高浓度SAA1高表达慢病毒转染则显著增加斑块的易损性。9.SAA1诱导胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达对小鼠颈动脉冰冻切片进行胶原Ⅰ的免疫组化染色发现,与control组相比,lenti-null组胶原Ⅰ的百分比未见显著改变(P>0.05); low-lenti-SAA1组胶原Ⅰ显著提高(P<0.05); high-lenti-SAA1组胶原Ⅰ无显著变化(P>0.05); high-lenti-SAA1组与low-lenti-SAA1组相比,胶原Ⅰ显著减少达到统计学差异(P<0.05)。胶原Ⅲ的免疫组化染色发现,与control组相比,lenti-null组胶原Ⅲ占斑块面积的百分比未见显著改变(P>0.05); low-lenti-SAA1组胶原Ⅲ显著提高(P<0.05)；high-lenti-SAA1组胶原Ⅲ显著减少(P<0.05); high-lenti-SAA1组与low-lenti-SAA1组相比,胶原Ⅲ显著减少(P<0.05)。Western blot结果与免疫组化结果一致。这一结果表明,低浓度的SAA1高表达慢病毒转染能显著增加颈动脉斑块内胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的聚集,但高浓度SAA1高表达慢病毒转染则逆转这一作用。体外培养的小鼠和人平滑肌细胞显示,SAA1刺激后,胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达呈剂量和时间依赖性增加,0.1μg/ml的浓度即可显著促进胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达(P<0.05)。免疫荧光结果表明,经过SAA1刺激后,胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达显著增加。10. MAPKs信号通路不介导SAA1诱导的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达上调经过不同时间的SAA1刺激后,p-JNK和p-p38MAPK的表达未发生显著改变(P>0.05); p-ERK1/2的表达均随时间的延长发生改变,刺激可使p-ERK1/2显著上调。然后分别应用JNK、ERK1/2以及p38MAPK的特异性抑制剂预处理平滑肌细胞,这三种抑制剂均未能显著抑制SAA1诱导的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达上调。上述结果充分说明了JNK、p38MAPK两条信号通路在平滑肌细胞内几乎未被SAA1激活,因此不参与下游的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的调控；而ERK1/2信号通路虽然能被SAA1激活,但却没有参与SAA1对胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的调控。11. Smad2/3信号通路介导SAA1诱导的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达上调经过不同时间的SAA1刺激后,p-Smad2和p-Smad3的表达均发生显著改变(P<0.05)。然后分别应用Smad2/3的siRNA预处理平滑肌细胞,这两种siRNA均能显著抑制SAA1诱导的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达上调。说明Smad2/3信号通路在平滑肌细胞内参与了下游的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的调控。12.SAA1诱导胶原I和胶原IⅡ表达上调不依赖于TGF-β1对小鼠颈动脉斑块冰冻切片进行TGF-β1的免疫组化染色,四组未见统计学差异,表明SAA1高表达慢病毒转染在小鼠颈动脉斑块内没有引起TGF-β1表达的改变。SAA1重组蛋白刺激平滑肌细胞不同时间,TGF-β1的表达未发生显著改变(P>0.05)；接着经过TGF-β1的siRNA及其特异性抑制剂SB431542干预后,SAA1诱导的胶原I和胶原III表达上调仍没有改变。这些结果充分证明SAA1诱导胶原I和胶原Ⅲ表达上调的过程不依赖于TGF-β1。13.SAA1通过增加MMP-2、MMP-8及MMP-9表达促进胶原降解对小鼠颈动脉斑块冰冻切片进行免疫组化染色,MMP1在四组未见统计学差异(P>0.05)。MMP8结果表明,lenti-null组、low-lenti-SAA1组与control组相比,MMP8占斑块面积的百分比未见显著改变(P>0.05); high-lenti-SAA1组MMP8占斑块面积的百分比显著升高(P<0.01)。体外培养的小鼠RAW264.7巨噬细胞中,1μg/ml和10μg/ml浓度的SAA1蛋白刺激巨噬细胞后,免疫荧光检测表明两个浓度均无法刺激MMP1表达显著升高(P>0.05);1μg/ml的浓度也无法显著增加MMP8的表达,但10μg/ml的浓度则显著增强MMP8的表达。Western blot结果显示,SAA1刺激后,MMP1的表达无显著改变(P>0.05)。而MMP8表达则呈剂量依赖性增加,当浓度达到5μg/ml以上时达到统计学差异(P<0.01)。此外1μg/ml的浓度的SAA1重组蛋白即可显著增加MMP2和MMP9的表达(P<0.05),随刺激浓度的升高,MMP2和MMP9的表达展现出剂量依赖性。以上结果表明,SAA1能够刺激MMP8、MMP2和MMP9的表达,并显示出剂量依赖性。结论：1.SAA1与实验性动脉粥样硬化斑块的稳定性密切相关；2.低浓度SAA1慢病毒转染能显著增加AS斑块的稳定性,而高浓度SAA1慢病毒转染则显著减低AS斑块的稳定性；3.低浓度SAA1即可增加胶原I、Ⅲ的表达,且0.1μg/ml的浓度即可达到刺激胶原I、III表达的最大效应；4.SAA1通过Smad2/3通路增加胶原I、III的表达,而与MAPKs和TGF-β1无关；5.浓度为5μg/ml以上的高浓度SAA1通过激活MMP-8促进胶原降解从而减低AS斑块的稳定性。