乌龙茶是福建省最主要的生产茶类,2014年乌龙茶产量达19.75万t,占全省茶叶总产量的53%。乌龙茶加工工艺独特,成品茶香气浓郁,滋味浓醇甘爽,品质优异,深受广大消费者的青睐,具有较高的经济价值和广阔的市场前景。茶叶香气物质的形成与萜烯类代谢途径、苯丙烷代谢途径、脂类代谢途径、氨基酸代谢途径、糖苷水解途径、儿茶素代谢途径等密切相关。做青工序是乌龙茶加工过程的关键工序,与成品茶的香气形成密切相关。本研究以铁观音鲜叶为供试材料,构建铁观音均一化cDNA文库,进行EST测序与分析,筛选出乌龙茶香气形成相关基因;以铁观音鲜叶和杀青前叶片为供试材料,构建抑制差减杂交cDNA文库,采用Northern-blotting筛选该文库,筛选出差异基因的阳性克隆,通过测序与EST分析,对香气形成相关基因进行生物信息学分析,预测其功能;采用荧光定量PCR技术,对获得的香气形成相关基因在茶树新梢不同发育时期、不同叶位及做青过程不同阶段的表达量进行检测,通过本研究初步阐明了乌龙茶做青过程中香气形成的分子机制,对于茶树种质创新、抗性育种、高香茶产品的研制都具有理论意义及应用价值。本研究的主要研究结果如下:1.构建了铁观音茶树均一化全长cDNA文库,分离出若干与乌龙茶香气形成相关的关键基因:以铁观音鲜叶总RNA为供试材料,结合两步法逆转录、抑制LA-PCR和DSN处理的方法,构建了铁观音茶树均一化全长cDNA文库,发现了若干参与乌龙茶香气形成的重要基因。经检测,该文库的初始滴度为1.97×105 cfu/mL,重组率为96.4%,插入片段在250-2 500 bp之间,平均大小为1200 bp,文库质量良好。从该文库随机挑取211个克隆进行测序,共获得178条有效的ESTs序列;序列拼接后有9条重复,冗余率为5.0%,因此首批共获得169条茶树ESTs。将测序结果在NCBI核酸数据库中进行Blast N 比对后,对序列进行功能注释和归类分析,结果显示,已知功能基因序列107条(约占63%),推测的功能基因序列36条(约占21%),未知基因序列19条(约占11%),已知染色体定位基因序列7条(约占4%);从中发现5个基因与乌龙茶香气形成相关,分别为NDR、IDI、NMT、HMGCL和SSL,其中参与萜类代谢途径3个(IDI、NDR和SSL),参与脂肪酸代谢途径(HMGCL)和苯丙烷代谢途径(NMT)各1个;同时还获得了 bHLH、WRKY和MYB等转录因子基因。2.构建了铁观音DSN介导-抑制差减杂交cDNA文库,筛选获得若干乌龙茶差异表达的香气相关基因:以铁观音鲜叶和杀青前叶总RNA为供试材料,经过两步法逆转录、ds cDNA扩增、ds cDNA杂交、DSN处理及差异cDNA扩增等步骤,成功构建了 DSN介导-抑制差减杂交cDNA文库,该文库的初始滴度为4.3×104cfu/mL,重组率为98%,插入片段在250-2500 bp之间,平均大小为1800bp;从该文库中随机挑取260个克隆,进行反向Northern-Blotting筛选,获得62个阳性克隆,阳性率为23.8%,对阳性克隆进行测序,获得了 60条有效序列,有2条出现重复,冗余率为3.22%;BLAST分析结果表明,在所获得的60条差异基因序列中,有34条为已知的功能基因序列,有10条为推测的功能基因序列,有12条为未知基因序列;其中与乌龙茶香气有关的差异基因序列有4条,分别为:G-10-H、SHT、SAMT和XPT,且这些差异基因是萜类代谢途径的关键基因,还获得了 14条与逆境胁迫相关的基因及激素应答的转录因子基因序列(ASIL、乙烯反应转录因子、乙烯应答元等)。3.对所获得的9个乌龙茶香气形成相关基因(CsIDI、NDR、G-10-H、SAMT、XPT、SHT、SSL、HMGCL和NMT)进行了生物信息学分析:对乌龙茶香气相关基因的克隆进行测序,结果表明:(1)CsIDI全长cDNA为1200 bp,含有194bp的5’-UTR、305 bp的3/-UTR和717 bp的ORF,编码238个氨基酸;(2)NDR序列长度为1075bp,含有44 bp的5/-UTR、128 bp的3’-UTR和903 bp的ORF,编码300个氨基酸;(3)G-10-H序列长度为 1713bp,含有 56 bp 的 5’-UTR、163 bp 的 3’-UTR 和 1494bp 的 ORF,编码 497 个氨基酸;(4)SAMT序列长度为 1019bp,含有 111 bp 的 5/-UTR、164 bp 的3/-UTR 和 744 bp 的ORF,编码247个氨基酸;(5)XPT序列长度为1568bp,含有109 bp的5’-UTR、139 bp的3’-UTR和1320 bp的ORF,439个氨基酸;(6)SHT序列长度为1532bp,含有69bp的5’-UTR、98 bp的3’-UTR和1365 bp的ORF,编码454个氨基酸;(7)SLL序列长度为1395bp,含有 93 bp 的5/-UTR、165 bp 的 3’-UTR 和 1137 bp 的 ORF,编码 378 个氨基酸;(8)HMGCL序列长度为 1553bp,含有 51 bp 的 5’-UTR、509 bp 的 3/-UTR 和 993 bp 的 ORF,编码 330个氨基酸;(9)NMT序列长度为1964bp,含有47 bp的5’-UTR、348 bp的3/-UTR和1569 bp的ORF,编码522个氨基酸。BLAST P分析结果表明,CsIDI基因在氨基酸序列上与葡萄、黄芪、橄榄、芝麻等植物的同源性都很高,达94%以上;NDR与咖啡、番茄、杨树、麻风树等植物的同源性不高,在68%～70%;G-10-H与黄金鸡纳树、蛇根草、水甘草的同源性较低,仅为65%～68%;SAMT与茶树(登录号:JQ406919.1)的同源性为99%,与可可、杨树、甜橙的同源性均为60%以上;XPT与芝麻、烟草、胡杨树、咖啡等植物的同源性均在73%～76%以上;SHT与莲、葡萄、梨树、苹果等植物的同源性均在54%～56%;SSL与葡萄、枣、柑橘、甜橙等植物同源性在68%～73%;HMGCL与出芽短梗霉菌的丙酮酸羧基转移酶、出芽短梗杆菌的HMGCL和黑醋杆菌的醛缩酶(二磷酸果糖酶)的同源性为77%～99%;NMT与葡萄、枣、芝麻、柑橘同源性在70%～82%。在线软件SOPMA分析CsIDI蛋白是Nudix水解酶家族成员,包含IPP异构酶位点、Idi蛋白保守区、金属结合部位和活性部位区;NDR是NADB家族成员,具有carb-red-PTCR-like和fabG保守的结构域,包含NDR的活性部位、辅酶结合部位和底物结合部位;G-10-H是p450 家族成员,包含 P450-rel-GT-act 和 P450-cycloAA-1 CypX 位点、PLN02738 和 MRS6 等结构功能域;SAMT是Methyltransf-7超级家族家族成员,包含Methyltransf和PLN02668两个结构功能域;XPT蛋白是EamA超级家族成员,包含EamA和TPT结合位点;SHT是Condensation和BAHD酰基转移酶家族成员;SSL是Str-synth和NHL超级家族成员,包含NHL和YvrE功能结构域;HMGCL是TIM-phosphate-binding超级家族成员,包含DRE-TIM-HMGL保守功能结构域及活性部位、金属结合部位;NMT包含rRNA-processing和nop2p保守功能结构域。综上所述,本研究所获得的9个香气基因均是茶树CsIDI、NDR、G-10-H、SAMT、XPT、SHT、SSL、HMGCL和NMT的同源基因,除了HMGCL参与脂肪酸代谢途径、NMT参与苯丙烷代谢途径外,其余7个基因均参与萜类代谢途径。4.筛选出了乌龙茶香气形成相关基因(CsIDI、NDR、G-10-H、SAMT、XPT、SHT、SSL、HMGCL和NMT)在不同发育时期、不同叶位及做青过程不同阶段表达量的变化规律:以茶树GAPDH为内参基因,采用荧光定量PCR技术,检测这9个基因在在不同发育时期、不同叶位及做青过程不同阶段表达量的动态变化,结果表明,在萜类代谢途径中,CsIDI、NDR、G-10-H、SAMT、XPT、SHT和SSL的表达量,随着发育过程和做青过程的推进,呈上调趋势,第三叶和第四叶的表达量高于第一叶和第二叶,与乌龙茶采摘标准需一定成熟度的开面叶相一致。参与脂类代谢途径途径的HMGCL在铁观音做青过程中,该基因的表达量也呈上调趋势,且上调幅度较大;HMGCL的表达量随着发育过程的推进和叶位的下移,表达量出现上调趋势,与乌龙茶采摘需要一定成熟度相一致。NMT参与苯丙烷代谢途径,其表达量在做青过程中动态表达呈上调趋势,且上调幅度较大;发育过程和不同部位的动态表达随发育进程和成熟度增加而增加,与乌龙茶采摘标准需要一定成熟度相一致。