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肝脏是最早进行细胞移植实验的器官之一。人肝细胞移植是当前医学研究的重点领域,它不但可作为有效的治疗手段,而且利用人肝细胞异种移植建立动物模型对于研究病毒感染性肝病大有裨益。异种肝细胞移植到具有免疫活性的啮齿动物体内会因宿主免疫系统的T淋巴细胞激活和迟发性超敏反应而排斥供体细胞。要克服异种移植引发的排斥反应可选用无免疫活性的小鼠作为受者,或是诱导产生针对移植物的特异耐受。免疫系统具有重要的识别功能,即识别自己和异己。对自身组织细胞产生耐受,而对非己组织细胞识别后,引起有效的免疫应答,通过排斥反应,从体内消除异己物质。实验证明,动物在胚胎发育时期接触到外来抗原会逐渐对这些抗原产生免疫耐受,出生后允许异种移植物在体内存活。本课题采用诱导胎鼠出生前对人胎肝细胞产生免疫耐受,出生后移植人胎肝细胞的方法,建立人鼠嵌合肝动物模型。而后接种乙型肝炎病毒(HBV)感染人血清,观察嵌合在具有正常免疫活性大鼠肝内的人肝细胞是否能感染HBV。实验方法和结果如下:一、人鼠嵌合肝动物模型的初步建立妊娠14～18日Wistar大白鼠。在无菌操作下,暴露孕鼠子宫,对胎鼠腹腔内注射人胎肝细胞。逐层缝合,让孕鼠自然生产。胎鼠出生后24小时内于新生小鼠脾内注射人胎肝细胞。采用免疫印迹法(Western blot)、逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)及免疫组织化学等方法,于不同时相检测实验大鼠血清人白蛋白、肝组织中人白蛋白mRNA及人肝细胞型细胞角蛋白CK18。结果于4、6、8周龄大鼠血清中测出人白蛋白;4、6、8、10周龄大鼠肝组织中测出人白蛋白mRNA;4、6、8、10、12周龄大鼠肝组织中有CK18表达。上述结果表明经过胚胎期人胎肝细胞诱导对其产生免疫耐受的胎鼠,出生后24小时内接受人胎肝细胞移植,不需要免疫抑制剂而能够在大鼠肝中存活。移植了人胎肝细胞的嵌合鼠能表达人白蛋白,说明移植的人胎肝细胞不仅在嵌合鼠肝内存活,而且能够保持一定的功能,维持近12周。 <WP=9>二、人鼠嵌合肝感染HBV的探索胚胎期人胎肝细胞诱导对其产生免疫耐受的胎鼠,出生后24小时内接受人胎肝细胞移植,1周龄时于大鼠腹腔内注射肝功能正常的慢性HBV携带者血清。血清病毒学标志为HBV表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)及核心抗体(抗-HBc)均阳性,HBV DNA定量为7.154E+07。采用自动生化分析仪、血清酶联免疫吸附反应(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、PCR及肝组织苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、免疫组织化学等方法,于不同时相检测实验大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、HBsAg、HBV DNA,以及肝组织病理变化和HBsAg。结果大鼠血清HBsAg阳性率于4、6、8、10、12周龄时分别为61.9%、52.3%、38.1%、30.9%、16.7%。接种HBV后4～12周龄所有实验大鼠ALT均出现了不同程度的增高,其中感染HBV者(称感染组)ALT值不同时相点明显高于未感染者(称未感染组),整体趋势为随着感染时间推移呈先升高后逐渐下降的过程,在8周龄时出现峰值。血清HBV DNA只在HBV感染组4、6、8、10周龄大鼠中检出,其检出率分别为69.2%、59.1%、68.8%、46.2%。病理观察显示,接种HBV后4～12周龄感染组和未感染组均有部分实验大鼠肝组织出现细胞浊肿、变性,汇管区炎性细胞浸润,但HBV感染组病理改变的检出率在各时相点明显高于未感染组。肝组织HBsAg阳性细胞只在HBV感染组4、6、8、10周龄大鼠中发现。统计分析显示肝组织病理改变检出率与ALT均值、血清HBV DNA及肝组织HBsAg检出率之间具有相关性。 结论:1.采用诱导胎鼠出生前对人胎肝细胞产生免疫耐受,出生后移植人胎肝细胞的方法,使移植到具有正常免疫活性大鼠体内的人胎肝细胞,不需免疫抑制剂而能够存活,并且保持人肝细胞的特性,产生人白蛋白,维持近12周。初步建立人鼠嵌合肝动物模型。2.给出生1周的移植了人胎肝细胞的大鼠接种HBV感染人血清,于4～12周龄可从血清中检出HBsAg和HBV DNA,且肝组织有HBsAg表达伴有轻度病理改变。初步证实移植到具有正常免疫活性大鼠体内的人胎肝细胞可感染HBV。