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目的：动脉粥样硬化(As)所致的心脑血管疾病是当今严重危害人类生命健康的疾病之一,其发病率和死亡率均居各种疾病之首。但是,动脉粥样硬化的病因尚未完全确定,治疗效果还不满意,因此探讨动脉粥样硬化的发生机制和寻找有效的治疗方法具有十分重要的意义。基因治疗的研究在不断的深入。众多的国、内外研究表明了动脉粥样硬化的基因治疗具有很广阔的发展前景,为动脉粥样硬化治疗开辟了新的途径。本课题拟通过重组的腺相关病毒(r AAV)介导人对氧磷酶1(hPON1)基因修饰骨髓内皮祖细胞(EPCs)对大鼠动脉粥样硬化模型治疗作用,并探讨了其可能的治疗的机制。方法和结果：1.骨髓内皮祖细胞的分离培养、鉴定本研究采用密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获取大鼠骨髓EPCs。Wright’s Giemsa染色观察其形态。免疫组化(vWF和flk-1抗原检测)及乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)摄取能力鉴定培养的内皮祖细胞,并研究其生长特性和克隆形成能力。结果显示,培养的内皮祖细胞Wright’s Giemsa染色,呈铺路石状,vWF和flk-1表达阳性,具有摄取乙酰化低密度脂蛋白(AC-LDL)的能力。EPCs的生长特性为：接种后第1～6d为潜伏期,从第6 d起细胞开始增殖并进入对数生长期。骨髓内皮细胞具有克隆形成能力,并且克隆形成的数目与再种植细胞数量之间呈良好的线性关系,接种4000、6000、8000、10000个细胞可分别形成23.00±3.00、31.0±3.6、43.33±3.51、62.33±2.52个内皮细胞集落。2.动脉硬化大鼠动物模型的建立雄性SD大鼠40只,随机分为A、B、C、D、E 5组,每组8只。A组喂食普通饲料,B、C、D、E组喂食高脂饲料。每月检测大鼠体重、血脂及超声检测主动脉病变,也进行了β-半乳糖苷酶染色检测大鼠血管内皮细胞衰老改变。三个月后,进行血脂、超声检测并随机抽取正常饲料组和高脂饮食组大鼠处死后取主动脉及肝脏组织HE染色观察组织结构改变。结果表明：正常饮食组SD大鼠血脂正常,超声及组织切片均未见主动脉血管出现病变,而高脂饮食组,血脂明显升高,彩超可见主动脉血管壁有斑块形成,内膜增厚等改变,组织切片也可见动脉血管壁出现明显病理改变,并有动脉粥样硬化斑块形成。肝脏病理切片观察显示,高脂饮食组肝脏结构紊乱,大部分肝细胞肿胀呈气球样变,并可见肝细胞空泡变性,而正常饮食组未见病理改变。3.获取携带PON1基因的重组腺相关病毒载体本研究中通过RT-PCR从人胎肝中扩增出1068bp大小的PON1基因,将其克隆入pAAV一IRES-GFP质粒中,通过酶切和测序鉴定,成功地构建了重组pAAV-PON1-IRES-GFP (pAAV-PONl)质粒；然后采用磷酸钙共沉淀法将三质粒pAAV-PON 1, pAAV-RC, pHe l per共转染HEK293细胞,包装含有人PON1基因的rAAV-PON 1-IRES-GFP (rAAV-PON 1):通过“硫酸肝素法”纯化获得rAAV-PONl:经SDS-PAGE蛋白电泳和“dot-b1ot"斑点杂交检测,获得高纯度的rAAV-PON,其滴度为1.77x1010v.g/ml。本研究用获得的rAAV-PON 1转染培养的大鼠骨髓来源的EPCs,经转染的EPCs可以检测至hPONl的表达,而未经转染的EPCs则没有hPON1的表达。4.移植PON1/EPCs. rAAV-PON1和(GFP/EPCs对动脉粥样硬化模型大鼠的治疗作用比较及机制的初步探讨在体外实验的基础上,我们将rAAV-GFP转染的EPCs(GFP／EPCs). rAAV-PON 1转染的EPCs(PONl／EPCs)及rAAV-PON 1病毒颗粒分别移植入动脉粥样硬化模型大鼠体内。移植后两个月,检测血脂水平；彩超观察血管结构的变化；HE染色观察主动脉及肝脏的组织学改变；荧光显微镜下观察冰冻切片GFP标记的细胞；RT-PCR检测主动脉壁一氧化氮合酶(eNOS).细胞间黏附分子1(ICAM-1)及载脂蛋白E(aDoE)及肝组织中C-反应蛋白mRNA的表达；免疫组化检测了血管壁eNOS、ICAM-1.apoE和ERK1/2抗原的表达；Western-blot检测人PON1蛋白的表达。通过以上的方法比较了分别移植PON1/EPCs.rAAV-PON1和GFP/EPC s对模型大鼠的治疗作用,并探讨了PON1基因治疗动脉硬化的机制。结果表明：rAAV-PON 1组及PON1/EPCs组血脂较未处理组有明显下降；主动脉彩超及HE染色可以检测到rAAV-PON 1组及PONl／EPCs组动脉粥样硬化斑块明显减少,而后者效果更为明显；肝脏病理切片显示rAAV PON1组和PON1/EPCs组与未处理组相比,肝细胞的空泡变及气球样变有所减轻；在GFP/EPCs组中动脉壁的脂质沉积也有减少；主动脉冰冻切片显示PON1/EPCs组和GFP/EPCs组大鼠的动脉血管壁均有GFP的表达,而在肝脏的冰冻可以看到GFP/EPCs组、rAAV-PON1组及PON1/EPCs组有GFP的表达；RT-PCR结果可以观察到与病理对照组相比各治疗组中ICAM-1、APOE、C反应蛋白的表达明显降低,而eNOS的表达有明显的增高；eNOS、ICAM-1、apoE免疫组化与RT-PCR结果是一致的,ERK1/2表达在各治疗组中明显下降；通过Western-blot可以在rAAV-PON1组及PON1/EPCs组的大鼠血管组织中检测到人PON1的表达。RT-PCR、免疫组化和Western-blot检测中,PON1/EPCs组的结果均较rAAV-PON1组和GFP/EPCs组明显；ERK1/2免疫组化的结果表明PON1可能通过减少了ERK途径诱导的细胞的迁移和增殖,对AS起到了治疗作用。结论：本研究在体外成功地分离培养大鼠骨髓来源的EPCs;并且通过rAVV载体有效地介导PON1在EPCs中的表达,获得PON1基因修饰的EPCs (PONl/EPCs);成功的建立了脉粥样硬化的SD大鼠模型；进一步研究表明EPCs、rAAV-PON1及PON1基因修饰的EPCs均对动脉粥样硬化有一定的治疗效果,而PON1基因修饰的EPCs治疗效果最为明显；PON1可能通过ERK途径起作用。