大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是重要的土传病原菌之一,引起多种重要经济作物的黄萎病,给世界棉花生产造成了严重危害。目前防控黄萎病的手段主要有化学防治、轮作倒茬、生物防治、选育抗病品种等。虽有一定成效,但由于黄萎病菌抗逆性强,多有变种,且致病机理复杂,导致这一病害难以根治。寄主诱导的基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS)是以RNAi为基础的,在寄主植物中产生siRNA(small interfering RNA),随后进入病原体体内发挥作用,从而特异性沉默病原体基因的一种新技术,在植物与病原菌(病毒、线虫、细菌、卵菌、真菌)互作中已经广泛应用,并取得很多成果,可能对棉花黄萎病的防治也有重要作用。为此,我们希望利用HIGS技术沉默黄萎病菌的生长发育或致病相关基因,进而达到防治黄萎病的目的。本研究以大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)基因组信息作为依据,通过文献查找,初步挑选了9类共91个大丽轮枝菌生长发育相关或致病相关基因作为备选基因,并挑选棉花的Chl I(黄化基因)、CLA1(白化基因)作为阳性对照基因,棉花材料选用陆地棉(Gossypium hirsutum L.)感黄萎病品种新陆早7号,载体选用棉花皱缩病毒(CLCr V)。分别进行了以下实验:1.利用CLCr V介导的HIGS载体沉默棉花体内大丽轮枝菌中的备选基因。将构建好的93个HIGS载体转入根癌农杆菌中,利用农杆菌侵染法接种棉花,之后进行大丽轮枝菌的接种,接种后持续观察棉花发病情况。2.从91个目的基因中挑选11个可能在大丽轮枝菌致病性中发挥重要作用的基因进行siRNAs实验,每个基因设计两个siRNAs,分别进行体外抑菌实验和棉花体内的抑菌实验,研究这些基因在大丽轮枝菌侵染棉花中的作用。本实验主要结论如下:1.分别采用蘸根法、灌根法、茎注射法对陆地棉新陆早7号进行人工接菌,孢子悬浮液浓度均为1.0×106个孢子/m L,最终发现茎注射法接种强度适中,发病情况均一,利于筛选本实验中相对抗性植株;2.利用棉花皱缩病毒(CLCrV)为中间载体成功构建了91个可能与黄萎病菌致病相关的基因载体,以及棉花中叶绿素相关基因Chl I(黄化基因)和CLA1(白化基因)的载体。成功沉默了棉花体内的Chl I和CLA1基因,棉花叶片分别出现黄化和白化表型,证明了由CLCr V介导HIGS瞬时沉默载体在棉花体内可以成功应用;3.为了更好地探究目的基因在病原菌与植物互作中的作用,我们从初步筛选并构建成功的91个目的基因载体中,选出可能在大丽轮枝菌生长发育中有重要作用的11个基因,进行深入研究。分别是根部特异表达基因5个,Vd17、Vd19、Vd22、Vd32、Vd155,效应子相关基因3个,Vd64、Vd66、Vd68,c AMP相关基因3个,Vd86、Vd87、Vd89。每个基因设计并合成了2个长度为21nt的siRNAs;4.将11个目的基因进行siRNAs体外抑菌实验。将大丽轮枝菌孢子悬浮液浓度调整至106 m L-1,在106 m L-1孢子悬浮液中添加siRNAs至终浓度为5μM,将孢子悬浮液浓度调整为1×103m L-1之后在MM培养基点板培养。与阳性对照和接种含有UR-siRNA的V991组比较发现,接种含目的基因siRNA的黄萎病菌的菌落生长状况并无显著差异,菌落直径经测量也无显著差异。5.将11个目的基因进行siRNAs棉花体内抑菌实验。于1×106m L-1的孢子悬浮液中添加siRNA至终浓度为5μM,采用茎注射法接种棉花植株。通过调查病情及表型观察发现,与阳性对照和接种携带UR-siRNA孢子悬浮液组比较,这11个携带目基因的siRNAs的孢子悬浮液接种棉花后发病情况不均一,病情指数差异并不显著。这说明,利用HIGS技术无法在棉花体内沉默大丽轮枝菌致病或生长发育相关基因。