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安丝菌素(ansamitocins)作为美登素的一种,临床上验证可以用来治疗白血病和肺癌,可以由珍贵束丝放线菌橙色变种(Actinosynnema pretiosum)产生。安丝菌素是由一系列芳香族化合物AP-0、AP-2、AP-3、AP-3’和AP-4组成,其中AP-3被证实为有效成分。众多研究表明:安丝菌素的生物合成过程首先是通过氨基莽草酸途径形成3-氨基5-羟基苯甲酸(AHBA),之后以AHBA为起始单位经过聚酮途径(PKS)碳链延伸并最终和AHBA上的氨基集团脱水缩合成大环。莽草酸合成路径是生物合成苯环类氨基酸的重要途径,它广泛存在于植物和微生物中。其中,3-脱氧-D-阿拉伯庚酮酸-7-磷酸合酶(DAHPS)EC(4.2.1.15),是催化莽草酸合成路径中的第一步。已有文献报道,珍贵束丝放线菌橙色变种中编码形成安丝菌素的基因簇(asm簇)里并未找到催化氨基莽草酸第一步反应的氨基DAHP合酶。但是GenBank报导中,珍贵束丝放线菌橙色变种的aroF基因(GenBank:AF056968.1)编码的DAHPS参与催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮酸-7-磷酸(DAHP)。 本研究为了在大肠杆菌中异源表达Ap-DAHP合酶并研究该酶的性质,先后采用了改变表达启动子(pET28a和pSE380)、引进转录促进因子(pCold)、融合基因伴侣(NusA、SUMO和GST)以及和分子伴侣共表达等策略。最终珍贵束丝放线菌橙色变种的DAHPS基因通过重组的pET28a-aroF质粒与分子伴侣GroEL/GroES共表达于大肠杆菌中,成功实现了该酶的异源可溶表达。此外,还通过镍柱对异源表达的可溶蛋白进行分离纯化,并进一步对其酶学性质进行了研究。实验结果显示,这个来源于珍贵束丝放线菌橙色变种的DAHP合酶明显表现出被其中一个底物PEP抑制的现象,而另一底物E4P则不然。实验还发现EDTA可以使这个DAHPS完全失去催化活性,但是一些二价金属离子尤其是Mn2+和Co2+可以激活其催化活性。多重序列比对、系统发生树分析以及纯化酶的酶学性质表明,该重组酶为Ⅱ型DAHP合酶。