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目的表观遗传学对肿瘤相关基因表达的调控已成为肿瘤研究领域中一个重要的研究方向。而DNA甲基化与去甲基化状态的改变是表观调控最经典的研究方向。DNA的羟甲基化是近几年来新发现的,可以使DNA甲基化状态发生改变的调控方式。DNA羟甲基化主要是由TET家族的TET1,TET2和TET3介导的。实体组织中的羟甲基化主要由TET1来完成。目前已有相关文献报道,TET蛋白在诸多肿瘤中表达量明显下降,以及随之出现的基因组5-hm C含量的下调。这些现象提示,TET参与的5-hm C对DNA的表观调控在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。在本课题中,我们主要研究TET1对胃癌生物学行为的影响,同时进一步研究TET1对胃癌相关基因的调控机制。方法本研究中,我们使用免疫组化(IHC),Western blot,Dot blot检测胃癌组织及细胞内TET1蛋白和5-hm C的含量。使用卡方检验分析了TET1的表达与胃癌临床病理数据之间的关系。使用TET1 sh RNA和TET1过表达质粒在胃癌细胞系中敲低和过表达TET1,后续使用CCK-8,划痕实验和transwell实验来观察TET1对胃癌细胞生物学行为的影响。使用实时定量PCR(q PCR)检测了TET1相关靶基因的表达量,并对这些潜在的靶基因的启动子区域使用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)来检测甲基化的程度。后续我们使用Glu MS-PCR检测了相关基因启动子区域的5-hm C的含量。在本研究中,我们还使用了Western blot检测了TET1敲低和过表达后AKT和FAK通路的活化状态,以明确TET1对胃癌细胞的影响是通过何种途径发挥作用的。在实验的最后,我们使用裸鼠皮下成瘤和腹膜转移模型来说明TET1敲低后在体内实验中增加了胃癌细胞的增殖和转移。结果(1)我们发现相对于癌旁组组织,TET1的表达在胃癌组织中明显降低(Wilcoxon检验p=0.036),同时基因组的羟甲基化的水平在肿瘤组织中也明显下降;(2)Kaplan-meier分析显示TET1高表达的胃癌患者的生存要优于TET1低表达的患者(p<0.01)。(3)在胃癌细胞系NCI-N87中敲低TET1可以通过CCK-8实验明显地观察到胃癌细胞的增殖(p<0.05),同时迁移和侵袭能力也增强(p<0.01)。而在SGC7901中过表达TET1可以明显抑制胃癌细胞增殖(p<0.05)和转移能力(p<0.01);(4)TET1可以引起经典的胃癌相关基因如PTEN启动子区域羟甲基化和甲基化的改变,TET1在NCI-N87中敲低后,PTEN启动子区域甲基化从1.5%升高到12%,而TET1在SGC7901中过表达之后,PTEN启动子区域甲基化从3%下降到0.9%。通过Ch IP我们证明了TET1可以结合至PTEN的启动子区域对其进行调控。(5)在动物实验中,相对于对照组,TET1敲低的胃癌细胞形成的肿瘤体积更大,重量更重(p<0.05)。同时相对于对照组,TET1敲低的胃癌细胞在裸鼠腹腔内形成了更多的转移结节(p<0.01)。结论通过本研究,我们发现TET1在胃癌组织中的降低。胃癌中下调的TET1引起了抑癌基因如PTEN启动子区域甲基化的增强,降低了PTEN的表达,活化了AKT和FAK通路,增加了胃癌细胞的转移能力,从而明确了TET1的缺失导致细胞恶性转变的机制。