黑木相思(Acacia Melanoxylon)属含羞草科(Mimosaceae)金合欢属(Acacia Mill.)。自然分布于澳大利亚布里斯班以南,至南澳州的东南部和塔斯马尼亚岛,是近年来我国南方引种的主要用材树种之一,它具有适应性强、速生丰产、用途广泛等优点。但由于种源地属热带地区,大多种源对低温仍较为敏感,引种实践证明,在闽北及其以北地区长势较差,闽北低温是其种苗越冬的主要限制因子;另外,其实生苗在栽培中性状分化十分严重,制约了高产质优的黑木相思人工林的发展。因此,研究黑木相思优树遗传多样性、抗寒性,鉴定寒胁迫诱导下差异表达基因的生物学功能,可为进一步阐明黑木相思的抗寒机理,培育出性状稳定的抗寒相思优良品系提供理论依据;这对黑木相思优良种源引种适宜区的选择、优异抗逆林木的早期选择和种质资源库建设具有重要而深远的意义。本研究采用ISSR分子标记技术分析了黑木相思优树遗传多样性,采用抗寒评估技术对供试黑木相思优树进行了抗寒性评估,采用cDNA-AFLP技术对黑木相思寒胁迫诱导差异表达基因进行了研究,主要结果如下:1建立了黑木相思基因组DNA快速提取方法采用1.5×CTAB法提取黑木相思叶状柄的基因组DNA,其分子大小约为48Kb,得率约为180-697.5μg﹒g-1, A260/A280=1.75～1.955,无需经RNase处理,可直接用于限制性酶切和ISSR分析。2采用均匀设计优化和建立了黑木相思ISSR-PCR体系,筛选了多态性高、稳定性好的ISSR引物10条,并对其扩增程序和引物退火温度进筛选优化。(1)黑木相思ISSR-PCR的体系:在20μL反应体系中,含引物0.30μmol·L-1、Mg2+ 3.00mmol·L-1,dNTP 0.15mmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.75U和模板DNA2.00ng·μL-1。(2)黑木相思ISSR-PCR的扩增程序:94℃预变性5min;接着进行33个循环:94℃变性35s,52-61.5℃退火52s,72℃延伸90s;循环结束后,72℃延伸10min。3黑木相思优树遗传多样性ISSR分析的验证用ISSR标记技术,采用上述优化的黑木相思ISSR-PCR反应体系和循环参数,从加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套(共计100条ISSR引物)中筛选出的10条引物,对37个黑木相思优树进行遗传多样性分析,结果显示: 37个黑木相思优树之间存在较高的遗传多样性;而引自福建不同栽培地域的优树之间的遗传多样性则相对较小,这与引种黑木相思种源背景资料相一致,与引种栽培事实相符。37个黑木相思优树间的Nei & Li(1979)遗传距离表明:供试的37个黑木相思优树之间存在较大的遗传分化,这种遗传分化显现出显著的地域性;相对而言,3个来自建瓯的抗寒优树相对具有较高的遗传多样性;16个引自广东的优良无性系根孽苗优树具有较高的遗传多样性和较小的遗传分化;7个引自广东的优良无性系采种实生苗优树遗传多样性最低,且遗传分化较大;这与引种黑木相思种源背景和种源试验的栽培客观事实相符。研究结果表明:ISSR分子标记技术适用于黑木相思的遗传多样性分析。基于ISSR标记的黑木相思37个优树的聚类分析表明: 3个引自建瓯的抗寒优树与其它34个黑木相思优树亲缘关系可能较远;引自广东的16个优良无性系根孽苗优树与其半同胞优树(7个优良无性系采种实生苗优树)优树聚为一支,说明了它们之间的亲缘关系;这与种源背景和栽培事实相符。研究结果表明:ISSR分子标记技术适用于黑木相思的亲缘关系鉴定。另外,筛选出的10个引物对3个抗寒优树的扩增,共扩增出了48个特异遗传位点,其中3个抗寒优树共有的特异遗传位点有22个,可作为区别于其他34个优树的ISSR分子标记,另外26个特异遗传位点可与22个共有特异遗传位点配合使用,作为3个抗寒优树之间相互区分的ISSR标记。4黑木相思的抗寒性评估应用电导法配以Logistic方程求拐点温度作为黑木相思的低温半致死温度,能较直观且准确地反映黑木相思的抗寒力和所能忍耐的低温极限,可作为黑木相思抗寒性评估的有效方法。黑木相思的抗寒性大小与其寒胁迫过程中,细胞中MDA含量累积幅度相关,即抗寒性强的无性系,其细胞中MDA含量累积幅度小,抗寒性弱的无性系,其细胞中MDA含量累积幅度大,因此,寒胁迫中,黑木相思细胞中MDA含量累积幅度大小可作为其抗寒性评估的检测指标。低温胁迫下黑木相思可溶性糖含量变化与其抗寒性的关系复杂,部分种源细胞可溶性糖累积与其抗寒性呈负相关;低温下黑木相思细胞可溶性糖的累积作用,对提高其抗寒性可能是间接的,更多的可能趋向于诱导启动抗寒的其它过程,间接提高抗寒性。低温胁迫下黑木相思脯氨酸含量变化与其抗寒性的关系复杂,部分种源细胞脯氨酸累积与其抗寒性呈负相关;低温下黑木相思细胞脯氨酸的累积作用,更多的可能趋向于提高细胞的渗透浓度,进而诱导启动抗寒的其它过程,或只是低温胁迫的结果。5建立了适于cDNA-AFLP的黑木相思组培苗总RNA快速提取方法采用改良CTAB-异硫氰酸胍裂解法能有效地控制多酚、多糖、蛋白质以及DNA等对所提取总RNA的污染,所得总RNA质量高、完整性好;紫外分光光度检测,A260/A280比值为1.96-2.0,A260/A230比值1.98-2.2,总RNA得率为118.4-213.6μg.g-1,电泳检测,28SrRNA亮度约为18SrRNA的两倍,所提RNA质量可以满足dscDNA合成和cDNA-AFLP等后续分子操作要求。6建立了黑木相思双低频酶cDNA-AFLP反应体系以黑木相思组培苗为实验材料,对影响cDNA-AFLP反应体系的关键因素进行了研究,建立了适用于黑木相思的cDNA-AFLP分析体系。结果表明:适用于黑木相思dscDNA的限制性酶切组合为EcoRI和PstⅠ,dscDNA酶切用量为500 ng。用作预扩增模板的连接产物稀释倍数为1倍,用作选择性扩增模板的预扩增产物稀释倍数为50倍。7寒胁迫诱导黑木相思差异表达基因的分离和鉴定采用cDNA-AFLP技术,得到黑木相思响应低温胁迫差异表达转录谱,并对图谱中有差异变化的147个TDF测序,测序结果在NCBI上进行同源性比对分析,其中下调表达基因为7个,上调表达基因为140个,这些基因主要有:锌指蛋白、GTP酶激活蛋白、鸟嘌呤核苷酸交换因子、蛋白磷酸酶-2A、MYB结构域蛋白、转录因子NAC、类受体蛋白激酶、蛋白质酪氨酸磷酸酶-受体型B、核糖核苷二磷酸还原酶、细胞色素P450、羧酸酯水解酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶、尿素酶辅助蛋白ureG、质膜H+-ATPase蛋白、核糖体蛋白S7、细胞周期蛋白、硫氧还蛋白等。本研究结果为进一步研究黑木相思的抗寒机理及差异表达TDFs相应基因在黑木相思应答低温中可能的作用研究奠定了基础。