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宫颈癌是引发发展中国家妇女高死亡率的一个主要原因,严重影响了全球女性健康。人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)的持续感染是诱发宫颈癌的主要病因,经鉴定HPV的DNA存在于99%以上的宫颈癌患者体内。HPV原癌蛋白E6、E7相互作用使得主要细胞调节蛋白功能失活,从而干扰细胞生长、分化、凋亡,导致细胞过度增殖引起癌变；通常将E6、E7作为宫颈癌免疫治疗的靶抗原。目前预防宫颈癌的疫苗已问世,预防性疫苗的出现可以降低世界范围内宫颈癌的发生,但是对于已发宫颈癌无治疗性作用。因此,宫颈癌治疗性疫苗的研究显得尤为重要。单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称LM)是一种兼性胞内寄生菌,能直接感染抗原递呈细胞,使所运送的外源抗原可以同时进入MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类抗原递呈途径,从而诱导强烈的CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫应答。目前,减毒李斯特菌作为一种新型的活疫苗载体,在抗肿瘤治疗中显示出诱人的前景。本研究以单核细胞增生性李斯特菌LM4为运送载体,通过同源重组的方法,成功地获得能够分泌表达密码子优化的HPV16E7的减毒重组李斯特菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3,在对这两株疫苗候选株的生长特性、稳定性、溶血活性及免疫反应性进行研究的基础上,以荷瘤小鼠为实验动物模型,对疫苗的安全性、治疗性效力及抗肿瘤机制进行了相关研究。1.表达密码子优化的HPV16E7的减毒重组李斯特菌的构建与鉴定本研究首先将编码HPV16E7蛋白的密码子全部替换成李斯特菌偏好性密码子,新的编码基因命名为E7-1；并在此基础上,将E7蛋白的24位和26位的氨基酸替换为甘氨酸(G),编码该蛋白的基因命名为E7-3。然后以LM4为运送载体,通过同源重组的方法,将密码子优化了的HPV16E7基因定点整合至LM4的hly基因信号肽序列下游,获得能够分泌表达E7蛋白的减毒重组李斯特菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3。提取两株重组菌的分泌蛋白进行Western blot分析,结果显示,用HPV16E7单抗可在66kDa处检测到目的条带,表明两株重组菌能够分泌表达具有良好免疫反应性的融合蛋白。溶血活性试验结果显示,将E7-1或E7-3基因插入LM4野生株的hly下游后LLO并未完全失活,并且重组菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3的溶血效价均低于LM4野生株。对两株重组细菌稳定性测定结果显示,E7-1、E7-3基因均能够在重组菌基因组中稳定存在。此外,生长曲线测定结果表明,两株重组菌株与亲本株LM4的生长趋势基本相同,说明将E7-1基因或E7-3基因插入到LM4基因组中以后,对细菌的生长趋势并没有造成明显影响。分泌表达密码子优化的HPV16E7蛋白的减毒重组李斯特菌的获得,为研究其抗肿瘤特性提供了生物材料。2.重组菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3在荷瘤小鼠模型中的治疗性效力评价本研究首先对重组菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3的安全性进行了相关评价。重组菌动态感染实验显示,在对小鼠免疫后的第7天,脾脏及肝脏中的细菌均被完全清除。对重组菌免疫鼠的脾脏及肝脏进行组织切片观察,结果显示,两株重组细菌感染小鼠之后,小鼠肝脏小叶间质内少量淋巴细胞浸润,肝脏中央静脉周围可见中性粒细胞浸润灶,而脾脏均无明显病理变化；而LM4△hly对照组小鼠肝细胞发生轻度颗粒变性及水泡变性,脾脏白髓内脾小体结构增大,说明重组菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3对小鼠的毒力显著降低,安全性较好。以C57BL/6小鼠建立肿瘤模型,通过腹腔免疫途径进行初次免疫和再次免疫,对重组菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3的治疗性效力进行评价。结果显示,LM4△hly组及PBS组的小鼠,随时间的推移肿瘤逐渐生长,至第36天时,两组中所有小鼠死亡；而免疫组小鼠经过疫苗免疫治疗后,部分小鼠体内肿瘤完全消除,剩余小鼠则肿瘤生长缓慢,LM4△hly::E7-1免疫组与LM4△hly::E7免疫组相比,表现出更显著的治疗性作用。夹心ELISA实验结果显示,重组疫苗菌免疫小鼠后,IFN-γ分泌水平要显著高于IL-4分泌水平,表明重组菌能诱导小鼠产生倾向于Thl型的免疫应答；LM4△hly::E7-1免疫组诱导小鼠分泌表达的IFN-γ水平显著性高于LM4△hly::E7免疫组(P<0.05),而LM4△hly::E7-3免疫组与LM4△hly::E7免疫组相比,无显著性差异。淋巴细胞增殖实验结果表明,在E749-57多肽刺激下,LM4△hly::E7-1免疫组与LM4△hly::E7免疫组相比,能够诱导小鼠淋巴细胞显著性增殖(P<0.05),而LM4△hly::E7-3免疫组与LM4△hly::E7免疫组相比,无显著性差异。另外,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)实验结果显示,疫苗株均能诱导荷瘤小鼠产生较强的E7特异性的CTL活性,LM4△hly::E7免疫组产生的E7特异性的CTL效应高于其他两免疫组,而PBS组和LM4△hly组小鼠体内没有产生特异性的CTL活性。以上研究结果说明LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3能够诱导小鼠产生倾向于Thl型的免疫应答及特异性CTL杀伤活性,为今后新型宫颈癌疫苗的研究提供了新思路。