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海豚链球菌(Streptococcus iniae)是一种具有β溶血特性的革兰氏阳性致病菌,由其引起的鱼类链球菌疾病对世界范围的水产养殖业造成了巨大的威胁,为了减少海豚练球的传播阻断大规模疾病的爆发,开发建立针对海豚链球菌的快速准确的检测方法显得尤为关键。海豚链球菌胶体金层析试纸条检测法是基于夹心法免疫结合原理进行目的抗原的检测。通过免疫后Balb/c雌鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行电融、筛选和亚克隆得到单抗分泌细胞株,并进一步制备单抗。通过本课题研究,共得到了 11株阳性较强的杂交瘤株,获得两株具有良好的特异性和效价单克隆抗体6C11和6G8。建立了以单抗6C11标记胶体金,实验室保存单抗E1H8包被检测线的胶体金试纸条系统,该抗体配对检测系统检测限达到2×105CFU/ml。在与6株常见的鱼类致病菌的交叉实验中,该系统与3株革兰氏阳性菌均发生了阳性结果。因此该海豚链球菌的胶体金层析试纸条检测系统仍然需要继续被完善。LAMP-胶体金双探针法(LAMP-AuNPs)是将环介导等温扩增法(LAMP)结合标记双探针胶体金颗粒的可视化的检测系统。利用胶体金能够发生自沉聚和生物偶联作用,同时开发双探针法充分结合微量核酸扩增物,使该系统达到检测结果明显可视、准确性高以及操作简便的目的。选择ATP转运相关基因fsB作为LAMP-AuNPs系统的目的基因。模板进行梯度稀释进行灵敏度检测和特异性比较结果表明LAMP-胶体金探针检测限为100 CFU(1.8 pg),是PCR核酸电泳和胶体金试纸条检测系统灵敏度的10倍和100倍,且对无乳链球菌、停乳链球菌、格氏乳球菌、溶藻弧菌和哈式弧菌进行检测时均未发生交叉反应。在斑马鱼的海豚链球菌浸染模型试验中该方法检测出染菌鱼的肝、肠和脾组织为阳性,以上实验数据证明LAMP-胶体金探针法同时具有可操作性和准确性,可用于实际的检测应用中。