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目的:邻苯二甲酸二乙基己酯(diethylhexyl phthalate,DEHP)是一种聚氯乙烯材料增塑剂,因其与塑料基质之间不形成共价键,而是以氢键和范德华力连接,故易从塑料中溶出而污染环境,对人类的健康造成影响。已有相关文献报导,DEHP是一种环境类雌激素,一旦进入人体,可对人类身体健康造成多方面的影响。DEHP对女性生殖健康的影响已得到广泛的关注。现有研究表明,卵巢是DEHP雌性毒性作用的主要靶器官。课题组前期实验发现,DEHP可以诱导新生鼠原始卵泡的发育出现异常现象,但其作用机制是如何产生的,并不清楚。自噬是真核细胞中普遍存在的生命现象,是将细胞内变形、衰老或损伤的蛋白质和细胞器转运到溶酶体腔中消化降解的一种代谢过程,在维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定中起着重要作用。因此,本文旨在研究自噬是否参与DEHP诱导新生鼠原始卵泡发育异常这一过程。方法:将健康6~8周龄清洁级成年雌性昆明鼠随机分为对照组和DEHP组,每组30只。待成年雌鼠生产后,采用腹腔注射方式,DEHP组按浓度×体重(g)/天(d),即0.62mg/kg/d、2.5mg/kg/d、5 mg/kg/d、10 mg/kg/d剂量对新生鼠进行腹腔注射,对照组注射相同体积玉米油,从新生鼠出生后第1天(1 day post-parturition,1 dpp)开始注射,每天1次,连续5天,注射结束后,第6天早上(6dpp)收集新生鼠卵巢组织,进行以下实验:(1)研究dehp对卵泡发育的影响:he染色观察新生鼠卵巢卵泡的发育情况;透射电镜观察dehp对新生鼠卵巢卵泡的影响;real-timepcr检测卵泡发育标志分子即生长分化因子9(growthdifferentiationfactor9,gdf9)mrna的变化情况。(2)研究dehp对新生鼠卵巢自噬形成过程中标志物的影响:westernblot检测自噬小体标志性蛋白lc3的表达情况;透射电镜检测自噬小体。(3)研究dehp对新生鼠卵巢自噬形成过程中关键蛋白的影响:real-timepcr检测ulk1、beclin1、atg5的mrna表达情况;westernblot检测p-ulk1、beclin1、atg5的蛋白表达水平。(4)研究dehp对新生鼠卵巢自噬形成的影响:westernblot检测ampk、p-ampk、mtor、p-mtor、p-p70s6k(t389)、p-4ebp1的蛋白表达情况;(5)研究dehp对自噬降解的影响:real-timepcr检测lamp2、p62、cathepsinb的mrna表达情况;westernblot检测lamp2、p62、cathepsinb、cathepsinl的蛋白表达情况。(6)研究dehp联合自噬抑制剂3-ma干预后对新生鼠卵泡发育的影响:he染色观察卵泡发育情况,并对卵巢中的原始卵泡进行计数。结果:采用dehp处理新生鼠之后,结果显示:?、he染色结果显示,与对照组比较,dehp处理组新生鼠,原始卵泡数量明显减少,且dehp浓度越高,原始卵泡数量减少得越明显。?、透射电镜下观察到采用dehp处理之后,卵细胞减小,透明带绒毛膜不明显,卵泡细胞数量减少,卵细胞发育迟缓。且采用低剂量0.62mg/kg浓度处理新生鼠之后,可在新生鼠卵巢组织中发现大量自噬小体的存在。?、Western blot结果显示,与对照组相比,DEHP处理组自噬标志性分子LC3蛋白的表达显著增加,与自噬形成过程相关的蛋白Atg5、Beclin 1、p-P70s6k(T389)、p-AMPK、p-mTOR的表达亦明显增加;p-ULK1、p-4EBP1表达明显降低;同时与自噬降解关系密切的蛋白LAMP2、Cathepsin L、Cathepsin B、P62表达亦显著增加。Real-time PCR结果显示Atg5、Beclin 1、LAMP2、Cathepsin B、P62、ULK1的mRNA表达结果与蛋白表达结果一致。(4)、HE染色结果显示DEHP联合自噬抑制剂3-MA处理后其原始卵泡数量明显增加。结论:在DEHP的作用下,新生鼠卵巢中的自噬小体增加,自噬形成过程增强,溶酶体对自噬体降解作用受损,自噬体堆积,提示DEHP引起卵巢组织自噬通路受损,自噬可能参与了DEHP引起的新生鼠原始卵泡发育异常。