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背景和目的:载脂蛋白C3(apolipoprotein C-Ⅲ,Apo C3)是一种水溶性低分子蛋白质,能够运载脂质及稳定脂蛋白的结构。主要抑制脂蛋白脂酶(lipoproteinlipase,LPL)活性,并且抑制肝脏摄取富含甘油三酯脂蛋白(triglyceride-richlipoproteins,TRLs)及其残余物,在血浆脂蛋白代谢中起重要作用。基础性临床研究成果揭示,App C3不仅是冠心病临床发病过程中具备代表性的独立风险因子,而且与2型糖尿病、高血压、肥胖等慢性疾病的发病风险程度具备密切相关性。目前已有研究表明,Apo C3作为体内参与脂质代谢的关键蛋白,具有调节多种免疫细胞分化和参与炎症反应等功能。本课题组选用Apo C3转基因小鼠与P-407小鼠模型做实验研究,以明确Apo C3对小鼠脾脏免疫细胞频率有何影响,且是否直接作用调节CD8+T细胞功能;进而探讨Apo C3转基因小鼠CD8+T细胞能量代谢特点及其相关分子机制。第一部分:载脂蛋白C3转基因小鼠及P-407小鼠脾脏免疫细胞频率及其活性目的:分析体内Apo C3过表达对小鼠脾脏免疫细胞生物学活性的影响,明确Apo C3是否可直接调节免疫细胞的表型及活性。方法:1.将健康SPF级雄性ICR野生型小鼠,体重约20～25g,随机分为P-407组和对照组两组。P-407组小鼠按0.5 g/kg体重隔日经腹腔注射泊洛沙姆-407,持续给药28天,建立长期HTG模型,对照组小鼠隔日腹腔注射等量PBS。2.以ICR背景Apo C3转基因小鼠和P-407小鼠为研究模型,从Apo C3转基因小鼠、P-407小鼠和年龄/性别匹配的野生型小鼠球后静脉丛采集血液,检测血浆中甘油三酯(TG)含量,选取血浆TG水平≥1000mg/dL(11.3mmol/L)的小鼠用于后续实验。3.处死小鼠后,取小鼠的脾脏制备成单细胞悬液,通过流式细胞术,分别检测转基因小鼠与野生型小鼠以及P-407小鼠与野生型小鼠脾脏内免疫细胞的频率。4.检测Apo C3转基因小鼠和P-407小鼠CD8+T细胞表型及活性。5.将Apo C3转基因小鼠脾脏细胞与野生型小鼠脾脏细胞分别与结肠癌细胞MC38以1:1、1:3、3:1浓度共培养后,检测CD8+T细胞CD107a的表达。结果:1.Apo C3转基因小鼠及P-407组小鼠血浆甘油三酯含量显著高于野生型小鼠,为后续实验提供了较理想的动物模型。2.与野生型小鼠相比,Apo C3转基因小鼠生理状态下脾脏CD3+CD8+、CD3+CD8+NKG2D+细胞频率明显增多,而P-407小鼠脾脏CD3+CD8+、CD3+CD8+NKG2D+细胞频率显著降低;Apo C3小鼠脾脏髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressorcell,MDSC)频率增高,而P-407小鼠髓系抑制性细胞频率降低;两者脾脏CD3-NK1.1+、CD3-NK1.1+NKG2D+细胞的频率均明显减少;脾脏 CD3+CD4+NKG2D+、CD3+CD4+IL-17+细胞的频率以及调节性T细胞、NKT细胞、γδT细胞、B细胞和巨噬细胞频率均无明显变化。3.Apo C3转基因小鼠CD8+CD62L-CD44+、CD8+CD44+KLGR1+频率升高,以效应性T细胞为主,且CD8+T细胞分泌IFN-γ活性增强,而P-407小鼠呈相反趋势。4.Apo C3转基因小鼠中CD8+T淋巴细胞CD107a的表达增高。结论:1.Apo C3转基因小鼠及P-407小鼠血浆甘油三酯水平均显著增高。2.Apo C3转基因小鼠CD8+T细胞频率及活性上调,但P-407小鼠CD8+T细胞频率下调。3.Apo C3转基因小鼠髓系抑制性细胞频率升高,而P-407小鼠中其频率下降;两者NK细胞频率均呈下调趋势。4.Apo C3转基因小鼠中CD8+T淋巴细胞对靶细胞杀伤能力增强。第二部分:Apo C3转基因小鼠CD8+T细胞能量代谢特点及其相关分子机制目的:探讨Apo C3转基因小鼠CD8+T细胞能量代谢特点及相关分子机制方法:1.以Apo C3转基因小鼠为研究模型,从Apo C3转基因小鼠和年龄/性别匹配的野生型小鼠球后静脉丛采集血液,首先检测血浆甘油三酯(TG)含量。2.处死小鼠后,取Apo C3转基因小鼠脾脏制备成单细胞悬液,采用磁珠阳性分选法分离Apo C3转基因小鼠和野生型小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞,用western blot法检测其脂蛋白脂酶LPL的表达。3.用流式细胞术检测生理状态下脾脏CD8+T细胞脂肪酸摄取受体(CD36)的表达,将CD8+T细胞用IL-2(10ng/mL)联合CD3抗体和CD28抗体刺激72小时,于静息和活化状态下分别检测细胞表面葡萄糖转运受体Glut1、己糖激酶HKⅡ(糖酵解关键酶)的变化以及胞内脂肪酸氧化限速酶-肉碱脂酰转移酶(CPT)和脂肪酸合成限速酶-乙酰辅酶A羧化酶(ACC1)的表达水平。4.检测胞内LKB1、AMPKα、AKT、mTOR及mTOR下游靶蛋白HIF-1α、c-Myc的表达变化。结果:1.与野生型小鼠相比,Apo C3转基因小鼠CD8+T细胞上调了 Apo C3靶蛋白LPL的表达。2.在静息和活化状态下CD8+T细胞葡萄糖转运蛋白Glut1、己糖激酶HKⅡ和磷酸化乙酰辅酶A羧化酶1 P-ACC1表达均上调,活化后胞内脂肪酸氧化限速酶肉碱脂酰转移酶CPT1表达下调;转基因小鼠CD8+T细胞表面CD36的表达增强。3.转基因小鼠CD8+T细胞活化后其P-mTOR表达明显增高;CD8+T细胞AMPKα、P-AMPKαα、LKB1和P-LKB1表达未见明显变化;活化后mTOR下游靶蛋白HIF-1α、c-Myc表达明显增高。结论:1.Apo C3转基因小鼠体内效应性CD8+T细胞表达增多,且其对葡萄糖和游离脂肪酸摄取增加,无氧糖酵解和脂肪酸合成均增加,活化的CD8+T细胞脂肪酸氧化磷酸化水平降低。2.在Apo C3转基因小鼠中,CD8+T细胞能量代谢方式及活性的变化可能与Akt-mTOR信号传导有关。