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类风湿性关节炎（RA）的治疗方法较多但均不能彻底治愈该病。因此新的药物靶点发现和生化药物开发一直是研究的热点。我们前期研究及文献检索发现低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在RA发病中扮演着重要的角色。RA患者的滑膜组织和巨噬细胞均过量表达HIF-1α，而且HIF-1α的过量表达可激发血管翳生成以及随后引起的关节软骨和骨的破坏等，因此HIF-1α有望作为RA治疗与病理探索的潜在靶点。 作为有效的基因沉默技术之一，RNA干扰（RNA interfering，RNAi）能将目的基因靶向性的沉默。RNAi技术已被研究者广泛应用于疾病治疗和特定基因功能的研究。HIF-1α相关病理功能研究不少，但慢病毒介导核酸沉默目的基因HIF-1α在RA病理发展中的体外、体内整体相关研究目前未见报道。本研究以慢病毒为载体并结合RNAi技术，将目的基因HIF-1α的外源性发夹结构干扰RNA(ShRNA)片段构建于慢病毒载体，利用基因重组技术构建稳定表达的HIF-1α-ShRNA的慢病毒颗粒。经过体外细胞实验观察慢病毒介导的ShRNA对目的基因HIF-1α及其相关基因的沉默效果，动物实验观察其对RA的疗效，并进一步验证HIF-1α在RA发病机制中的作用。 本研究主要分为以下三个部分 第一部分:慢病毒介导ShRNA载体及胶原诱导关节炎大鼠模型构建 构建携带HIF-1α-ShRNA的质粒表达载体并鉴定其正确性和测定病毒生物活性滴度;构建胶原诱导大鼠关节炎(CIA)模型模拟人RA发病状态为后续研究提供研究对象。设计合成针对HIF-1α基因的ShRNA，克隆至含有CMV启动子的质粒表达载体中，采用酶切琼脂糖凝胶电泳、载体质粒测序鉴定克隆片段的正确性。克隆正确的质粒包装病毒后瞬时感染293T细胞观察荧光表达，然后进行病毒生物滴度测定。CIA模型构建用牛Ⅱ型胶原(CⅡ)与等体积的不完全弗式佐剂(IFA)混合乳化物注射距离大鼠尾根部大约1厘米处，二次免疫后每天观察大鼠发病情况。利用关节炎指数及测量踝关节宽度评估关节炎严重程度。成功构建了慢病毒介导的ShRNA质粒表达载体pLVX-ShRNA-puro-rHIF-1α，酶切鉴定及测序结果表明插入的外源基因序列正确，并获得需要生物活性滴度的病毒。此外成功构建了CIA模型其关节炎指数及关节宽度较正常大鼠关节有显著性增大(P＜0.05)。 第二部分:CIA大鼠滑膜细胞分离培养及筛选有效沉默HIF-1α的慢病毒介导ShRNA序列 分离培养CIA大鼠的关节滑膜细胞进行体外沉默效果的筛选。构建有活性的病毒进行体外细胞感染并进行目的基因HIF-1α及其相关基因表达检测。本部分实验主要分为CIA大鼠滑膜细胞组(CSC)，干扰序列病毒组及阴性序列对照组。通过Real-time PCR(RT-PCR)、Western blot、免疫组织化学及免疫荧光共聚焦显微镜等实验手段检测目的基因HIF-1α及其相关基因血管内皮生长因子(VEGF)的表达。对细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的浓度进行检测。成功分离培养并获得了CIA大鼠的关节滑膜细胞。经过体外细胞筛选出干扰序pLVX-ShRNA2-puro-rHIF-1α(后面实验命名为pLVX-ShRNA-HIF-1α)的干扰效果最好且稳定，阴性病毒命名为（pLVX-ShRNA-conHIF-1α）。实时荧光定量PCR、Western blot、免疫组织化学和免疫荧光共聚焦显微镜等检测发现pLVX-ShRNA-HIF-1仅能有效的抑制HIF-1α及其相关基因VEGF的表达。细胞培养上清液中的IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度测定，结果表明CSC组和pLVX-ShRNA-HIF-1α组明显低于pLVX-ShRNA-conHIF-1α组(P＜0.05)。 第三部分:体外筛选的有效沉默HIF-1α的慢病毒介导ShRNA序列对CIA大鼠治疗效果的研究 成功构建并经过体外细胞筛选出的有效沉默HIF-1α的慢病毒介导的ShRNA序列进行动物疗效观察。采用病毒复合物滴度为1×108TU/mL注射大鼠发病的膝和踝关节腔。本研究分为pLVX-ShRNA-HIF-1α治疗组，正常动物组，pLVX-ShRNA-conHIF-1α和PBS组。每次注射0.1mL每周注射2次，共2周，通过关节炎指数、不同时间点血清炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）浓度、X-Ray、Micro-Computed Tomography(Micro-CT)、骨矿物密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、组织学（H&E染色、甲苯胺蓝、免疫组化等）检测及评分结果评估ShRNA对CIA的疗效。结合光声成像技术观察干扰后CIA大鼠模型的血管生成情况。治疗后不同时间点炎症因子检测显示pLVX-ShRNA-HIF-1α能有效降低血清中相关炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的浓度。放射学X-Ray和Micro-CT3D结果显示pLVX-ShRNA-HIF-1α能有效的抑制关节破坏，Micro-CT定量分析表明BMD、BV/TV和Tb.N等在治疗后15d和30d pLVX-ShRNA-HIF-1α组数值明显高于pLVX-ShRNA-conHIF-1α和PBS组。组织学H&E染色结果显示pLVX-ShRNA-HIF-1α治疗组动物不同时间点的关节破坏、炎症细胞侵入明显得到了抑制。甲苯胺蓝染色表明pLVX-ShRNA-HIF-1α治疗组动物关节软骨破坏明显得到改善。破骨细胞数量统计结果表明较pLVX-ShRNA-conHIF-1α和PBS组，pLVX-ShRNA-HIF-1α治疗组动物破骨细胞数量明显下降。免疫组织化学染色结果表明较pLVX-ShRNA-conHIF-1α和PBS组，pLVX-ShRNA-HIF-1α治疗组动物HIF-1α和VEGF蛋白的表达明显降低。光声成像观察显示较pLVX-ShRNA-conHIF-1α和PBS组，pLVX-ShRNA-HIF-1α组动物关节肿胀区域血管增生信号较低。 综上所述:通过体外细胞筛选的pLVX-ShRNA-HIF-1α能有效沉默目的基因HIF-1α。经过模式动物体内疗效验证pLVX-ShRNA-HIF-1α能有效抑制CIA模型大鼠的炎症发展和血管增生，能显著的改善关节软骨和软骨下骨的破坏。本研究进一步验证了RA病理过程HIF-1α具有重要作用，该研究有望为RA药物靶点和药物开发提供新思路和策略。