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糖苷化的类黄酮衍生物,不仅仅是决定茶饮料涩味品质的主要成分,也与茶树的抗性特征相关。本论文从茶树中克隆出一条受到与植物抗性胁迫相关的类黄酮糖基转移酶基因;实验发现,原核表达的融合蛋白对多种底物包括柚皮素,芹菜素,槲皮素,山奈素,杨梅素,山奈酚和山奈酚单糖苷均检测到活性;这种糖苷化反应可以发生在黄酮醇的3-OH、7-OH等多重位点上。超表达烟草叶片中也检测到多个黄酮醇糖苷产物积累的增加。本论文主要研究结果如下:1.以茶鲜叶cDNA为模板,利用RACE技术获得了一条类黄酮糖基转移酶基因的cDNA全长;其cDNA全长为1789bp,包括3’端非编码序列(236 bp),5’端非编码序列(128bp),开放阅读框(1428 bp);它编码了475个氨基酸残基,预测蛋白的分子量为53.72kDa,等电点为5.62。信号肽分析表明该基因不含有信号肽。进化树分析将该基因归类于ClusterⅢa组,预测可能克隆了一条7-OH糖基化类黄酮糖基转移酶。同源建模结果表明,该蛋白与VVGT1晶体结构的一致性为31%,分子对接表明,CsUGT73A20可以同时进行3,7糖苷化。该基因提交给UGTs命名委员会,并被命名为CsUGT73A20。2.构建了pMD19-T和pMAL-C2X重组质粒,将CsUGT73A20开放阅读框转化到表达菌株Novablue中。诱导表达后,对融合蛋白进行了洗脱分离,得到纯化后的蛋白。利用HPLC及UPLC-MS检测技术,对重组蛋白的酶活产物进行鉴定,结果表明黄烷酮(柚皮素),黄酮(芹菜素)和黄酮醇(山奈酚,槲皮素,杨梅素、山奈素)及黄酮醇苷(山奈酚3-O-葡萄糖苷和山奈酚7-O-葡萄糖苷)均是它的底物;对于多羟基的黄酮醇底物而言,可以检测到多重产物,推测糖苷化反应还可以发生在黄酮醇的多位点羟基上。3.酶动力学实验表明,在35℃,pH8条件下,柚皮素(N)、芹菜素(A)、山奈酚(K)、槲皮素(Q)、山奈酚3-O-葡萄糖糖苷(K3G)、山奈酚7-O-葡萄糖糖苷(K7G)和山奈素(KC)底物的KM分别为13.6μM、18.2μM、4.9μM、37.7μM、27.5μM、13.1μM和19.0μM,表明山奈酚可能是体内最适底物。实验还发现,当以山奈酚为底物时,多羟基糖苷化产物受到反应pH值的影响,在pH为8.0条件下,3-O-7-O-葡萄糖糖苷产物含量最高,而在pH9.0时则3-O-葡萄糖糖苷产物最高。但是KM值检测表明,无论是pH为8.0还是9.0条件下,山奈酚7-O-葡萄糖底物的KM值均小于3-O-山奈酚葡萄糖底物,表明3-OH糖苷化反应是该酶的主要反应,pH9.0条件对7-OH糖苷化的影响大于3-OH的。4.构建了植物过表达载体pCB2004-CsUGT73A20,并对其进行烟草和拟南芥的遗传转化。PCR验证结果显示,目的基因CsUGT73A20已成功转入烟草和拟南芥中。烟草转基因植株质谱分析表明该基因在植物体内同样具有糖基转移酶功能。