烧伤脓毒症是重症烧伤常见而严重的并发症之一，其来势凶猛，病程进展快，常并发MODS，若得不到及时有效的防治，病死率较高。负氮平衡是烧伤脓毒症时蛋白降解增强的重要代谢特征，占机体细胞干重50％强的骨骼肌蛋白高分解代谢是负氮平衡的主要原因之一。但目前烧伤脓毒症时骨胳肌蛋白高分解代谢的机制尚未完全阐明。 研究目的 我们既往的研究发现，烧伤脓毒症大鼠骨骼肌蛋白降解率与血内糖皮质激素以及TNF(肿瘤坏死因子)-α、白细胞介素(IL)-6等炎性介质的浓度关系密切。此外，机体细胞内有多种蛋白降解途径，那种途径在烧伤脓毒症骨骼肌蛋白高分解代谢中扮演主要角色呢?泛素系统是近年来新发现的蛋白降解途径，目前研究认为该系统在骨骼肌蛋白高分解代谢中有重要作用。我们的实验也发现，烧伤脓毒症大鼠骨骼肌内泛素系统的基因和蛋白表达显著增强。基于以上研究，本实验试图通过动物实验、离体组织孵育、细胞培养和临床观察四个方面，进一步探讨糖皮质激素、炎性介质以及泛素系统在烧伤脓毒症骨骼肌蛋白高分解代谢中的作用及其分子生物学机制。 材料和方法 1．动物实验 (1) 分别给正常大鼠注射不同剂量的地塞米松或TNF-α，离体孵育伸趾长肌，高效液相色谱法测定总蛋白和肌纤维蛋白降解率，核糖核酸印迹法和免疫组织化学染色法分析泛素系统的基因和蛋白表达变化。 (2) 使用含有TNF-α的孵育液，离体孵育大鼠伸趾长肌，分析蛋白降解率以及泛素系统的基因和蛋白表达变化。 (3) 建立大鼠烧伤脓毒症模型，结合使用糖皮质激素拮抗剂 漱 要 军医进修学院硕土论文 RU朋486干预，分析骨骼肌蛋白降解率以及泛素系统的基因和蛋白表 达变化。通过放免法测定血内皮质醇和炎性介质浓度变化。 2．骨骼肌细胞培养 （1）建立稳定的大鼠骨骼肌细胞离体培养增殖、融合方法。 （2）L－「3，5－3H卜酪氨酸标记肌管蛋白合成。 （3）使用含有不同浓度地塞米松或TNF－口的培养液，井结合使 用蛋白酶体抑制剂MG 32培养肌管，于不同时间点收集标本。液闪 计数仪测定肌管卜【3，5－3H卜酪氨酸的释放量，计算短寿命、长寿命 蛋白降解率。分析肌管内泛素系统的基因表达变化。 3．临床部分采集患者（9例大面积烧伤病人，9例整形待手 术患者）的骨骼肌（肪二头肌、股四头肌）以及血、尿标本，检测 血内皮质醇和炎性介质浓度以及尿内3－甲基组氨酸含量变化，分析 骨骼肌内泛素系统的基因和蛋白表达变化。 一 1．糖皮质激素与骨骼肌蛋白代谢 山地塞米松能显著增强大鼠骨骼肌泛素系统基因和蛋白的表 达以及骨骼肌总蛋白，特别是肌纤维蛋白的降解率，在一定范围内， 此作用呈剂量依赖关系。糖皮质激素受体桔抗剂RU38486能阻断此 作用。 （2）糖皮质激素受体桔抗剂RU38486能显著抑制烧伤脓毒症大 鼠骨骼肌泛素系统基因和蛋白的表达，降低骨骼肌蛋白降解率。 （3）地塞米松能上调肌管内泛素系统的基因表达，增强肌管蛋白 降解率，此效应在一定范围内呈剂量依赖关系。蛋白酶体抑制剂 MG 32能阻断地塞米松对肌管蛋白降解率的增强作用。 2．TNP与骨骼肌蛋白代谢 ＊）静脉注射TNF－a能上调骨骼肌泛素系统的基因和蛋白的表 达，增强大鼠骨骼肌蛋白降解，而此作用能被糖皮质激素受体桔抗 剂RU38486部分阻断，提示TNF－Q增强骨骼肌蛋白降解的作用在一 定程度上是由糖皮质激素所介导。 3 粉 要 军医进修学院硕士论文 C 离体孵育实验发现，TNF－口能直接作用于骨骼肌组织，增强 泛素蛋白酶体途径的活性，但TNF－a能否直接增强骨骼肌蛋白分解 代谢尚有待进一步探讨。 ＊细胞培养实验发现，TNF－口既能上调肌管内泛素系统的基因 表达，也能增强肌管蛋白降解率，蛋白酶体抑制剂MG132能阻断TNF－ a对肌管蛋白降解率的增强作用。