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禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）作为一种常见的致病菌,常与其他病原体相互作用,引起禽大肠杆菌病甚至直接导致禽类死亡。因此,加强对APEC致病机制的研究,对养殖业发展和公共卫生防控具有重要意义。Ⅲ型分泌系统2（Escherichia coli type Ⅲ secretion system 2,ETT2）是2001年在肠出血性大肠杆菌O157:H7基因组中发现的一种Ⅲ型分泌系统,参与细菌毒素分泌与运输等致病过程。EtrA是ETT2的5个转录调控因子之一,其对LEE毒力岛的蛋白分泌能力有抑制作用,参与细菌黏附等过程。Omp W是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中的小型外膜蛋白（Outer membrane prorein,OMP）,这些OMPs涉及脂质代谢、细胞黏附、膜结构稳定性以及应激适应等。实验室前期研究基于转录组学发现EtrA影响基因ompW的转录水平。本研究利用荧光定量PCR和β-半乳糖苷酶试验,探究基因etrA对ompW的转录调控作用。进而利用Red同源重组系统构建?ompW及?etrA?ompW缺失株,并结合实验室前期构建的缺失株?etrA,评价etrA调控ompW对APEC生物学特性的影响,最后结合体外、体内致病性试验评价其对APEC致病能力的影响。主要的研究内容和结果总结如下:1.ETT2转录调节因子EtrA调控外膜蛋白Omp W的转录水平为了探究ETT2转录调节因子EtrA对外膜蛋白ompW的转录水平是否具有调控作用,本研究构建了etrA过表达株pET32a-EtrA,荧光定量PCR方法检测pET32a-EtrA的etrA转录水平,结果显示pET32a-EtrA的etrA转录水平极显著增强（P＜0.001）,说明etrA过表达株构建成功。检测ompW在缺失株?etrA和过表达株pET32a-EtrA中的转录水平,结果显示在?etrA中ompW转录水平下降（P＜0.05）,在pET32a-EtrA中ompW转录水平上升（P＜0.01）,表明etrA对ompW有调控作用。进一步利用Red同源重组技术构建?etrA?lac Z、?lac Z基因缺失株,分别电转入含有ompW启动子的p RCL-ompW,检测?lac Z-pompW和?etrA?lac Z-pompW的β-半乳糖苷酶浓度,结果显示?lac Z-pompW的β-半乳糖苷酶浓度比?etrA?lac Z-pompW高（P＜0.01）,表明转录因子EtrA对ompW的转录水平具有调控作用。2.EtrA调控ompW对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响利用Red同源重组技术构建?ompW和?etrA?ompW,结合实验室保存?etrA菌株。生长曲线结果显示,野生株AE40与缺失株?etrA、?ompW和?etrA?ompW的生长性能无明显差异（P＞0.05）。运动性检测结果显示?etrA、?ompW和?etrA?ompW的运动能力显著低于野生株AE40（P＜0.01）。生物被膜形成试验结果表明,?etrA的生物被膜形成能力较野生株显著增强（P＜0.01）,?ompW的生物被膜形成能力同野生株生物被膜形成能力无明显差异（P＞0.05）,而?etrA?ompW的生物被膜形成能力较野生株极显著增强（P＜0.001）。环境耐受能力试验结果显示,与野生株AE40相比,?etrA、?ompW和?etrA?ompW在酸胁迫条件下存活率明显下降（P＜0.05）;?etrA、?ompW和?etrA?ompW在高渗透胁迫条件下存活率显著下降（P＜0.01）;?etrA、?ompW和?etrA?ompW在碱胁迫条件下存活率极显著下降（P＜0.001）;?etrA、?ompW和?etrA?ompW在70℃热胁迫条件存活率明显下降（P＜0.05）。上述实验结果表明基因etrA、ompW缺失改变了APEC的某些生物学特性。3.EtrA调控ompW对禽致病性大肠杆菌致病性的影响通过体外和体内致病性试验探究etrA和ompW基因对禽致病性大肠杆菌致病力的影响。体外血清杀菌实验结果表明,?etrA、?ompW和?etrA?ompW在体积分数为100%的血清中抗血清杀菌能力显著低于野生株（P＜0.01）,在体积分数为70%、50%或10%的血清中抗血清杀菌能力低于野生株（P＜0.05）,而在热灭活血清中缺失株与野生株的抗血清杀菌能力无明显差异（P＞0.05）。溶血性试验结果表明基因etrA、ompW与细菌溶血性无关。细胞黏附侵袭试验结果显示,与野生株AE40相比,etrA的缺失显著地增强了APEC对鸡气管粘膜上皮细胞的黏附侵袭能力（P＜0.01）,而?ompW和?etrA?ompW显著地降低了APEC对鸡气管粘膜上皮细胞的黏附侵袭能力（P＜0.01）。细胞感染后炎性因子转录水平检测结果显示,与野生株AE40相比,?etrA、?ompW和?etrA?ompW感染细胞2h后,TNF-α、IL-1β、IL-6的转录水平显著升高（P＜0.01）。体内致病性结果显示,etrA、ompW缺失降低了禽致病性大肠杆菌对宿主的致病力,降低了宿主气管、心脏、肝脏的损伤程度。总而言之,这些结果表明基因etrA、ompW缺失降低了禽致病性大肠杆菌的致病能力。综上所述,本研究成功构建过表达株pET32a-EtrA,基因缺失株?etrA?lac Z、?lac Z以及与报告基因lac Z的转录融合体?lac Z-pompW和?etrA?lac Z-pompW,发现EtrA对ompW基因的转录可能存在正向调控作用。成功构建?ompW和?etrA?ompW缺失株,且相较于野生株AE40,缺失株的运动能力、耐酸、耐碱、耐盐、耐热能力、抗血清杀菌能力及致病力显著降低,但对生长性能和溶血能力无明显差异。?etrA和?etrA?ompW生物被膜形成能力显著增强。?etrA细胞黏附侵袭能力明显增强,?etrA?ompW细胞黏附侵袭能力降低。表明etrA和ompW参与调控APEC的生物表型和致病过程,进而影响APEC致病机制。