骨髓间充质干细胞(MSCs)是具有多向分化潜能的成体干细胞,逃避宿主免疫系统监测、免疫调节和体外培养易扩增等特点,使骨髓间充质干细胞在细胞治疗方面特别有应用前景。然而,移植细胞的死亡限制了组织再生。移植入器官的干细胞死亡主要机制之一由缺血引起。缺氧/局部缺血情况作为凋亡的一个重要的媒介和调节因素早已经得到了认识。这种情况下引发了活性氧簇(ROS)的大量产生。过多的ROS直接损伤了细胞膜,DNA和蛋白质,导致细胞功能的改变和丧失并引起细胞增殖抑制和诱导凋亡.芒果甙是一种四羟基吡啶的碳糖甙,属双苯吡酮类化合物。现代的药理和临床研究证明,芒果甙以及含芒果甙植物提取物具有多方面的生理和药理作用,如抗脂质过氧化反应、抗癌、抗糖尿病、抗炎、抗病毒、止咳、免疫调节等作用.应用骨髓间充质干细胞进行细胞移植,细胞的存活率低。通过在缺氧状态下,引入抗氧化剂对细胞进行抗氧化、抗凋亡的保护非常有意义。芒果苷成为有前景的抗凋亡剂,有望为提高细胞移植的干细胞存活提供理论依据及实践经验。尽管国内外对芒果苷抗氧化的研究已经积累了一些资料,但是对芒果苷对骨髓间充质干细胞缺氧损伤保护的机制研究却未见报道。本课题在体外实验的研究基础上,利用细胞和现代分子生物学等技术,通过氯化钴构建的缺氧模型,检测在体外环境中对大鼠骨髓间充质干细胞的生物学影响;通过芒果苷预处理,观察芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡和氧化应激的保护作用;通过实时荧光相对定量RT-PCR和Western-blot等方法分别测定凋亡相关基因和氧化应激相关基因和蛋白表达,探讨芒果苷在缺氧模型下对大鼠骨髓间充质干细胞的保护机制。实验内容包括以下四部分:第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定及生物学性状分析目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化,进行染色体分析和荧光增殖示踪分析。结果:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。结论:实验所用的全骨髓贴壁法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。第二部分芒果苷的提取、鉴定、代谢动力学及其对大鼠骨髓间充质干细胞生物学性状的影响目的:研究芒果苷的提取、鉴定、代谢动力学及其对大鼠骨髓间充质干细胞生物学性状的影响方法:通过乙醇回流法提取并经过萃取、预处理、再生、洗脱及重结晶等方法得到芒果苷提取物。对芒果苷提取物通过紫外及红外吸收,核磁共振,高效液相色谱(HPLC),鉴定提取物的化学结构和含量。通过口服给药,进行芒果苷在大鼠血液中药代动力学的评价。通过药物细胞毒性试验(MTT法)、细胞周期分析、细胞增殖荧光示踪等,检测芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞的生物学性状影响。结果:用乙醇回流法提取的芒果苷浓度可达98.0%和94.9%,其纯度已经可以满足药效试验的需要。高效液相色谱(法),可测量出芒果苷在小鼠血浆中的含量切实、可行。低浓度芒果苷(20-80μmol/l)能促进大鼠骨髓间充质干细胞生长,以40μmol/l芒果苷促进效果最好;而高浓度芒果苷可抑制细胞生长,具有浓度依赖性。结论:通过乙醇提取可获得高纯度芒果苷,并可通过高效液相色谱检测芒果苷含量。芒果苷对细胞生长有一定影响。第三部分芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧诱导的凋亡保护机制研究目的:研究芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的凋亡保护机制方法:建立细胞缺氧模型。通过MTT、流式细胞仪凋亡检测、流式细胞仪线粒体膜电位检测细胞凋亡率、实时荧光相对定量RT-PCR和Western-blot方法分别测定了细胞中Casapse3、Casapse8、Casapse9、Bcl-2及Bax等凋亡相关基因及蛋白表达情况。结果:芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤具有保护作用,呈浓度依赖性;随着芒果苷浓度的增加,大鼠骨髓间充质干细胞在缺氧损伤模型下的凋亡率逐步减少(P<0.01)。氯化钴可引起Casapse3、Casapse8、Casapse9、Bax等凋亡相关基因及蛋白表达上调,Bcl-2基因及蛋白表达下调。芒果苷能抑制氯化钴引起的Casapse3、Casapse8、Casapse9、Bax等凋亡相关基因及蛋白表达的上调(P<0.01),及减少Bcl-2基因及蛋白表达的下调(P<0.01)。结论:芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤诱发的凋亡具有保护作用,并呈浓度依赖性。第四部分芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的抗氧化保护机制研究目的:研究芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的抗氧化保护机制方法:建立细胞缺氧模型。通过紫外可见光分光光度计检测细胞内及细胞培养液中的氧化应激相关指标:超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等。用流式细胞仪检测细胞活性氧含量。实时荧光相对定量RT-PCR和Western-blot方法分别测定了细胞中RelA、HIF-1α、Hsp70等氧化应激相关基因及蛋白表达情况。结果:芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤具有保护作用,呈浓度依赖性;随着芒果苷浓度的增加,大鼠骨髓间充质干细胞在缺氧损伤模型下的氧化应激反应逐渐减少(P<0.01)。氯化钴可引起RelA、HIF-1α、Hsp70等氧化应激相关基因及蛋白表达上调。芒果苷能抑制氯化钴引起的RelA、Hsp70等氧化应激相关基因及蛋白表达的上调(P<0.01),但对HIF-1α基因的表达和蛋白表达没有影响(P)0.05)。结论:芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤诱发的氧化应激具有保护作用,并呈浓度依赖性。