【背景】世界范围内每年约新发430,000例膀胱癌(Bladder cancer,BCa),BCa高发于男性,其发病率在男性肿瘤患者中占据第4位,在女性肿瘤患者中发病率排名为第11位。就病理类型而言,绝大多数膀胱癌均为尿路上皮肿瘤(urothelial carcinoma)。不同病人的临床特征和病理情况呈现较强的异质性。70%的肿瘤表现为浅表性的肿瘤,即非浸润肌层性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC),尽管预后尚可,但其复发率高达50-70%,其中约有10-20%的病人进展至肌层浸润;另有30%的病人表现为肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),其转移及死亡率均较高。因此寻找合适的分子标志物,进行正确的危险分层、预测哪些病人更易进展为肌层浸润性膀胱癌,对于改进治疗手段和判断临床预后具有重要意义。KLF15(Krüppel-like factors 15)是KLF家族成员分子,该家族分子作用机制多,作用途径广,调控细胞增殖、分化和迁移,参与细胞多潜能性的建立维持和肿瘤微环境的调控,并与肿瘤干细胞的形成有关。近年来已有多项研究证实其肿瘤中抑癌和致癌作用,但其在膀胱癌中的具体作用尚未研究,其功能机制尚未阐明。【目的】探讨KLF15在膀胱肿瘤及正常尿路上皮中的表达高低情况,研究KLF15与膀胱癌病理分期分级及预后的关系,探究KLF15在膀胱癌的发病、侵袭和进展中的作用。【材料和方法】1.进行配对膀胱癌与癌旁组织的转录组测序,根据转录组测序结果,结合公共数据库及相关文献,研究KLF15在膀胱癌中的表达情况。2.提取病人膀胱肿瘤组织和癌旁组织的蛋白质和RNA,通过免疫印迹法和实时荧光定量PCR研究KLF15在蛋白水平和RNA水平的表达情况。3.通过TCGA和GEO数据库,以对KLF15在膀胱肿瘤组织的表达情况进行外部验证。4.通过免疫组化染色的方式,从我院既往临床病理样本验证膀胱肿瘤组织的KLF15表达量,并研究其是否与患者的病理分期分级及预后资料相关;将膀胱癌根治术的肿瘤标本制成完整全层大切片,比较同一病人的尿路上皮、癌旁、肿瘤浅表、肿瘤组织内部不同层面以及膀胱平滑肌中的KLF15表达差异。5.通过免疫印迹法和实时荧光定量PCR验证KLF15在正常尿路上皮细胞系和膀胱癌不同细胞系中的表达量。6.通过质粒和si RNA构建KLF15过表达和敲减的膀胱癌细胞系,通过CCK8细胞增殖实验研究KLF15对膀胱癌细胞增殖的影响,通过细胞划痕和Transwell小室侵袭实验,研究KLF15对膀胱癌迁移和侵袭能力的影响。通过流式细胞技术研究KLF15对膀胱癌细胞凋亡的影响。7.通过BBN饲喂诱发小鼠自发产生膀胱癌,利用免疫组化的实验方法检测对照组、不同分期膀胱癌及膀胱癌肺部转移小鼠的KLF15表达量情况。8.通过生物信息分析、UMUC3-KLF15过表达/对照表达谱芯片分析来探讨KLF15转录调控的下游基因,并通过定量PCR来验证相关结果。【结果】1.全转录组测序结果显示,与癌旁正常组织相比,KLF15在膀胱癌组织中表达显著降低(P<0.01)。2.实时定量荧光PCR结果和蛋白免疫印迹法结果显示,膀胱癌患者的肿瘤组织KLF15蛋白表达量和RNA水平表达量低于癌旁组织(P<0.01)。3.TCGA及GEO数据库显示,在GSE3167的膀胱肿瘤和非肿瘤组织、TCGA肿瘤和癌旁及GTEx正常尿路上皮中,KLF15表达量均在肿瘤中显著下调(P<0.05)。4.123例膀胱肿瘤组织的免疫组化的结果显示,KLF15表达量在MIBC中显著低于NMIBC,KLF15低表达组患者,在OS、DSS和PFS等预后指标方面,均显著低于高表达患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。5.对RT4、BIU87、UMUC3、T921及5637细胞蛋白质和RNA进行检测,发现MIBC细胞系(UMUC3、T921及5637)KLF15表达低于NMIBC细胞系(RT4及BIU87)。6.构建KLF15敲减的BIU-87细胞株和KLF15过表达的UMUC3细胞株,CCK8细胞增殖实验结果显示敲减和过表达后细胞增殖能力未见明显降低(P>0.05);划痕实验显示,与对照组相比,KLF15敲减的BIU-87细胞迁移能力显著增强(P<0.001),KL15过表达的UMUC3细胞迁移能力显著降低(P<0.001);Transwell小室侵袭实验显示,与对照组相比,KLF15过表达可显著降低UMUC3膀胱癌细胞的侵袭能力(P<0.001),KLF15敲减则增强BIU-87细胞的侵袭能力(P<0.001)。流式细胞术检测结果显示过表达或敲减KLF15不影响膀胱癌细胞的凋亡(P>0.05)。7.BBN诱导不同时期膀胱肿瘤中,免疫组化结果显示,KLF15表达量与肿瘤侵袭性呈负相关,KLF15在正常尿路上皮组织中表达高于肿瘤组织,在肿瘤组织中与分期负相关。8.结合UMUC3-KLF15过表达/对照表达谱芯片及转录组测序结果取交集,选取HDGF为候选下游基因,定量PCR结果证明,UMUC3细胞中过表达KLF15导致HDGF下调,敲减KLF15导致HDGF显著上调(P<0.05)。【结论】KLF15在膀胱肿瘤组织中表达量显著下调,其表达水平与膀胱癌分期分级、肌层浸润负相关,KLF15的低表达是膀胱癌预后的危险因素,低表达预后差。过表达KLF15可以降低膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。在膀胱癌细胞系中,敲减KLF15导致HDGF上调,是导致膀胱癌侵袭进展的可能潜在机制。