大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV)病是一种世界性大豆病害,严重影响大豆产量和品质。由于SMV基因组的遗传变异及强大的选择压力,产生了不同的致病类型,即株系。在中国,基于一套全国统一的SMV株系鉴别体系,我国研究者鉴定报道了 SC1～SC22 共 22 个株系,其中 SC3、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC13、SC15、SC18为中国各大豆生态区危害的强毒株系。据报道大豆对SMV各株系抗性的遗传多数由个别基因控制,以株系分类体系的不同而有不同。伴随着SMV的变异可能出现新株系,从而打破原有的抗性。鉴于同一地区存在多个株系,新株系还在产生,抗病毒育种要求一个品种兼抗多个株系,或者要求品种具有广谱抗性。为此,需要探索具有广谱抗性的基因,RNAi机制近年来被广泛认知,它可以保护生物免受病毒感染,是公认的生物体内的抗病毒调节机制,据研究报道应用RNAi机制获得了广谱的抗番木瓜环斑病毒植株,因此,应用RNAi原理获得对病毒的广谱抗性具有较大潜力。同时,为了检验广谱抗性基因的功能,还需要建立一个快速验证的技术体系,利用同一种转有抗性基因的大豆基因型检验对不同株系的抗性。本研究的目的是探求对大豆SMV株系具有广谱抗性的RNA干扰基因,同时建立一套广谱抗性鉴定的技术体系。研究的基本路线如下:(1)利用病原物来源的抗病(Pathogen-derived Resistance,PDR)机制,设计SMV来源的RNA干扰基因和过表达基因,期望从中获得具有广谱抗性的基因。(2)对所获基因进行抗SMV功能验证需要建立一个快速验证体系,鉴于大豆再生和转基因技术的困难,尝试了2种设想:一是寻找可以被SMV侵染的可做瞬时表达的烟草或拟南芥,建立SMV与烟草或拟南芥的抗性鉴定技术体系;二是建立大豆发状根抗性鉴定技术体系。研究结果两条路线都有发现:SMV分离物4278-1打破了本氏烟非寄主抗性,由此建立了一对一的抗性鉴定体系;还成功建立了 SMV侵染发状根体系,此体系可应用于同时对多个株系的抗性鉴定。(3)利用设计的RNA干扰基因和抗性鉴定体系,对我国各生态区的强毒株系进行了相对广谱抗性功能检验。主要结果如下:1.筛选到能克服本氏烟非寄主抗性的SMV分离物4278-1为了筛选克服非寄主烟草和拟南芥抗性的SMV株系,对3种烟草(本氏烟、普通烟、黄烟)和拟南芥(Col-0)适龄幼苗分别机械接种SMV分离物SC3*(隶属SC3株系)、4278-1(隶属SC7株系)、6067-1(隶属SC15株系)、6003-2(隶属SC18株系),发现SMV分离物4278-1能侵染本氏烟,表现出皱缩和矮化症状。通过酶联免疫吸附试验(ELISA),透射电子显微镜观察病毒粒子形态和回接大豆NN1138-2试验,证实侵染本氏烟的病毒确为SMV。此外,回接试验表明该分离物在大豆NNN113-2上的毒力没有减弱、致病型未发生改变。同时,分离物4278-1在寄主大豆和非寄主本氏烟上具有相似的潜伏期,但诱导不同的症状。鉴于该分离物能侵染本氏烟,此体系将用于检验后续克隆的各RNA干扰基因对以分离物4278-1为代表的SC7株系的抗性效果。2.揭示了克服本氏烟非寄主抗性的SMV分离物4278-1的分子生物学特征为了获得SMV分离物4278-1在本氏烟上转导情况,分别收获接种后7天、14天和21天侵染植株的各片叶,利用qRT-PCR对3个时间点各片叶病毒含量进行分析,结果显示该病毒分离物能移动到非接种叶,从而引起本氏烟系统性侵染。对分离物4278-1全基因组测序,发现该分离物全基因组(单链RNA)由9994个核苷酸组成,不同于一般的SMV分离物的基因组(约含95 8 8个核苷酸)。分离物4278-1与本文涉及的其它SMV分离物在氨基酸序列上同源性大于89%,但在P1蛋白区域,该分离物氨基酸序列与其它SMV分离物的同源性较低(43.8～45.4%),而与西瓜花叶病毒(WMV,69.6%)有较高同源性。通过系统发育树构建和重组分析,发现SMV和WMV在P1基因和5’非翻译区发生了两个重组,分别位于1-476 bp和1145-1349 bp。因此,这一重组的病毒不仅可侵染寄主大豆,还可以克服本氏烟的非寄主抗性。文献报道SMV的SC7株系分离物4469-4也有类似的重组现象,这表明SC7是一个重组活跃株系,其5’端是重组活跃区域。非寄主抗性可被打破这一结果为揭示植物-病毒互作机制提供了一种新的可能。3.SMV来源的RNA干扰基因赋予了本氏烟对SMV的抗性通过 NCBI(National Center For Biotechnology Information)获得了 46 条 SMV 全基因组序列,应用BioEdit软件(muscle算法)对它们的核苷酸序列进行同源性比较分析,筛选到5个相对保守的片段(分别命名为S1～S5),它们在SMV基因组上的位置(核苷酸)分别是:S1(2595-3056 nt)、S2(5601-6013 nt)、S3(6930-7426 nt)、S4(8261-8582 nt)、S5(8919-9274 nt)。利用RNAi抗病毒机制,分别构建了 5个反向重复干扰序列的沉默载体。同时,扩增SMV基因组CP基因,构建了 1个过表达载体。在非寄主本氏烟上瞬时表达构建好的载体,分别接种SMV分离物4278-1或侵染性克隆pGreen-SMV-GUS,对5个干扰基因(S1～S5)及CP过表达基因抗SMV效果进行功能验证。研究发现设计的基因都有抗SMV分离物4278-1和侵染性克隆pGreen-SMV-GUS的效果,但各个基因的抗性水平不同。根据表型、GUS染色、GUS酶活、ELISA、Western blot和qRT-PCR试验结果,发现基因S1抗SMV效果较强,基因S2抗SMV效果较弱,基因S3～S和CP抗病效果介于S1和S2之间。因此,推测S1基因可能可以用于遗传转化那些农艺性状优异但抗SMV株系SC7能力弱的栽培大豆,进而增强品种抗病毒能力。4.沿基因介导的大豆发状根对中国各大豆生态区强毒株系的广谱抗性利用发根农杆菌K599在大豆子叶创伤处诱导愈伤组织,农杆菌接种后8～10天,对形成的愈伤组织进行针刺造成伤口,在其上接种SC15株系病毒纯化制剂,接种后14天,取从愈伤组织生长出来的发状根,进行ELISA检测和回接感病大豆NN1138-2测试。研究发现对发状根的ELISA检测呈阳性,回接的大豆表现出典型的SMV病症状,表明应用此种方法SC15确实侵染了大豆发状根。随后,对SMV株系SC3、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC13和SC18分别采取同样的方法进行接种试验,结果发现上述病毒株系均可侵染大豆发状根。因此,该体系可用于相关SMV株系抗病基因的功能验证。此外,对接种后10天、15天、20天和25天发状根的表型进行了观察,结果发现病毒与Mock(缓冲液)接种之间没有差异,二者表型类似于野生型对照,并无病症出现。为获知在发状根中RNAi是否起主要抗SMV作用,扩增了番茄丛矮病毒基因沉默抑制子基因p19,将其在大豆发状根稳定过表达,接种强毒株系SC15病毒纯化制剂,于接种后10天、15天、20天和25天对发状根中病毒含量进行qRT-PCR检测。结果发现在4个时间点,过表达基因沉默抑制子基因p19的发状根中病毒含量显著高于对照组(野生型和空载体)发状根,p19基因的表达促进了 SMV强毒株系SC15在发状根中的累积,说明在发状根对SMV的抗性中RNAi起着很大作用。利用发根农杆菌K599将干扰基因S1在大豆中稳定表达,针刺愈伤组织,接种SC15株系病毒纯化制剂,于接种后10天、15天、20天和25天对发状根中病毒含量进行qRT-PCR检测。结果发现随着接种时间延长,发状根中SMV含量逐渐累积,但表达干扰基因S1的发状根中病毒累积速度显著低于对照组(野生型和空载体)发状根。此外,相对于接种后10天、20天和25天,在病毒接种后15天时,对照组发状根和表达干扰基因S1的发状根病毒含量差异较大,因此,对于其它株系的抗性验证选此时间点取样,并进行病毒含量检测。随后,本研究用同样的病毒接种方法和qRT-PCR检测技术,验证了干扰基因S1对SMV株系SC3、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC13和SC18的抗病效果,发现S1基因对不同的株系均有抵抗作用,且抗性水平表现差异较小,说明基因S1具有相对广谱的抗SMV能力。