Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的表达及序列测定与分析

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本研究将Ⅰ型MDV Md11株的pp24基因的完整ORF克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒pGEX-pp24转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达。诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达。将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,五次免疫后,采血分离血清。所得血清分别与GA、Md11和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFA),结果表明大肠杆菌表达的pp24基因至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性。 将Ⅰ型MDV Md11株的pp38基因和pp24基因的完整ORF分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)中,重组质粒pcDNA3.1-pp38和pcDNA3.1-pp24在脂质体作用下分别转染CEF,在转染后24、48、72小时,用单抗H19和pGEX-pp24原核表达产物制备的抗血清分别对pcDNA3.1-pp38和pcDNA3.1-pp24转染的CEF进行IFA检测,结果检测到了pp38和pp24在CEF中的表达,该试验也使pp24基因在原核和真核系统中的表达得到了相互验证。 为研究pp38和pp24之间的关系,将Ⅰ型MDV Md11株的pp38基因和pp24基因的完整ORF克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,转染CEF后,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行Western-blotting试验检测到了pp38和pp24磷蛋白的共表达。 对包括Ⅰ型MDV疫苗毒、强毒、超强毒、特超强毒共7个国际参考株与7个中国分离野毒株的pp24基因和pp38基因分别进行了克隆测序,序列分析结果表明,Ⅰ型MDV的pp24基因和pp38基因均非常保守,比较的15个毒株的pp24基因的核苷酸和氨基酸之间的同源性分别高于98.9%和98.1%,同时比较的14个毒株的pp38基因的核苷酸和氨基酸之间的同源性分别高于99.4%和99.0%。除了pp38基因的第320位(A→G)和第326位(A→G)核苷酸发生变异,相应的第107位(Q→R)和第109位(E→G)氨基酸发生改变最终导致抗原位点发生变化外,两个基因中的其它核苷酸变异均未引起明显的抗原性改变。对pp24基因和pp38基因进行同源性比较分析的结果表明,绝大多数毒株二者的前195个核苷酸完全一致,不同毒株间的第81位核苷酸的差异(G/C)并不引起编码的氨基酸变化,仅仅与地域分布有关,这很可能是MDV在长期病毒衍化过程中形成的地域性遗传标志,而与病毒的分离年代及MDV的致病型等因素无关。 另外,本文还用pp38特异的PCR产物标记的核酸探针,对来自包括台湾在内的全国10个省37个鸡群共792只鸡的病理组织样品进行了检测,同时用REV SNV株全基因组cDNA克隆标记的探针检测REV,用CAV Cux-1株全基因组克隆标记的探针检测CAV。结果表明:发病鸡中这三种病毒的检出率均相当高,分别为84%(MDV)、62.8%(CAV)和58.8%(REV):病鸡中存在非常严重的双重感染(32.6%)和三重感染(45.7%);37个鸡群中的28个存在三重感染(75.6%),5个鸡群存在MDV和CAV的共感染(13.5%),3个鸡群存在MDV和REV的共感染(8.1%),仅有1个鸡群未检测到这三种病毒;在地域分布上,除了广西未检测到CAV外,其余的9个省份均检测到了MDV、CAV和REV,显示这三种病毒在我国已广泛存在。
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