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目的：
为了更好地研究肠癌细胞的恶性生物学行为，本研究拟建立一种更能模拟体内肿瘤微环境的体外三维培养模型。考虑到经济效益及实验条件，选择使用猪结肠进行脱细胞处理，并将其应用于肠癌细胞HCT116细胞的体外培养，对于构建的脱细胞支架的一般表型进行鉴定，观测细胞在支架上的粘附、生长、增殖、凋亡等，评价该支架能否较好的支持结肠肿瘤细胞生长，进而初步探讨HCT116细胞在结肠脱细胞三维培养模型构建的微环境下的生物学表现和二维培养的差异。
在明确了猪结肠脱细胞三维支架培养肠癌细胞的可行性后，进一步探讨了三维支架诱导肿瘤细胞表达的的EMT标记物与耐药蛋白Bcl-2和二维培养相比是否存在差异。
在建立了三维脱细胞支架-肠癌细胞培养模型的基础上，进一步观察现阶段临床主要抗肠癌药物氟尿嘧啶及祛瘀解毒汤对HCT116细胞干性水平的影响，结合祛瘀解毒汤的复方优势，探究其是否能抑制HCT116细胞向EMT转化的同时，抑制HCT116CSCs发生再分化，减缓HCT116细胞的增殖进展。在药物干预HCT116细胞后，观察耐药蛋白Bcl-2的变化，探讨祛瘀解毒汤作为增加疗效、提高化疗敏感性的作用。
方法：
通过化学联合物理方法制备猪结肠脱细胞支架，观察支架的大体形态，用扫描电子显微镜观察超微结构，通过切片、H&E染色进行组织学观察评价脱细胞程度，在结肠黏膜层种植HCT116肠癌细胞，检测其存活、形态、黏附、增殖情况，从横向、纵向评价该支架对于模拟体内肠癌发展的表现，评估该支架进行细胞培养的可行性。通过免疫荧光、Western-Blot法探究，对比传统二维培养，三维支架培养对于HCT116细胞的干性、耐药性的影响。通过免疫荧光检测不同药物组对HCT116细胞表达EMT相关标记物E-cadherin、vimentin分子的影响。通过观察药物干预HCT116CSCs诱导分化后的细胞形态，探索不同药物对于肿瘤干细胞再分化的作用。通过Western-Blot法检测经不同药物组处理后，HCT116细胞的耐药分子Bcl-2的表达情况。
结果：
经过脱细胞处理后，猪结肠大体外观变成白色透明状，黏膜层明显软榻，肠壁菲薄；扫描电镜可观察到支架黏膜层的肠隐窝结构保存完整，在支架表面形成大小、分布均匀的多孔结构，孔隙的形状偏圆，较规则，孔径大小范围在40-60μm。HE染色观察到脱细胞支架仍保留清晰的四层结构，分别为黏膜层、黏
膜下层、肌层和浆膜层，无明显DNA残留。同新鲜猪结肠组织相比，脱细胞结肠组织的杨氏模量更大。
荧光显微镜下动态观察HCT116细胞在支架黏膜层的生长与活动，首先，可以观察到细胞从隐窝中逐渐增殖平铺在黏膜表层并逐渐蔓延生长成片覆盖整个黏膜层；其次，能在细胞培养第7天观察到细胞能向黏膜下层纵向生长，表现出的浸润性生长的特点。
免疫荧光结果发现，相比二维培养的HCT116细胞，脱细胞支架培养能使HCT116细胞高表达波形蛋白vimentin，低表达细胞黏附分子E-cadherin；同时，Western-Blot结果发现，与二维培养对照组相比，在脱细胞支架上培养HCT116细胞的Bcl-2蛋白水平也是明显增高的。
基于脱细胞支架三维培养，对HCT116细胞进行药物处理，免疫荧光结果发现，经药物处理7天后，单纯使用和联合氟尿嘧啶使用75mg/ml祛瘀解毒汤处理后，HCT116细胞的E-cadherin增加且vimentin表达减少，而单纯使用50μmol/L氟尿嘧啶处理后的细胞与空白对照组无明显区别。
基于三维培养条件下，观察联合不同药物组的含血清培养基诱导HCT116CSCs的分化情况发现，HCT116干细胞在不加药物或单纯加入50μmol/L氟尿嘧啶后可以再次分化，细胞形态由圆形转化为段梭形片状；加入75mg/ml祛瘀解毒汤的组别，均表现为圆润形态，聚集在支架的隐窝中，甚至有成球倾向。
在三维培养条件下，对HCT116细胞进行药物处理，Western-Blot结果发现，与空白组相比，单纯使用50μmol/L氟尿嘧啶培养或75mg/ml祛瘀解毒汤培养后的HCT116细胞的Bcl-2蛋白表达增多，而祛瘀解毒汤联合氟尿嘧啶处理后的Bcl-2表达明显减少。
结论：
1.脱细胞后，结肠黏膜层表面能观察到均匀分布的天然细胞龛洞，孔隙的大小适合细胞的种植，且该方法制备脱细胞支架能有效地完全去除核或核碎片。与脱细胞之前相比，该支架还具有更强的刚度，在拉伸断裂前可以承受更大的力。
2.猪结肠脱细胞支架提供的肠隐窝可形成的天然龛洞，对HCT116细胞能起到很好地富集作用，细胞能在支架上进行正常的生长、增殖；细胞能产生向黏膜下层纵向生长的倾向，表现出的浸润性生长的特点。
3.基于猪结肠脱细胞支架的三维培养能增强HCT116细胞的干性，诱导HCT116细胞产生更强的耐药性。
4.在使用中药干预的情况下可以抑制HCT116细胞发生EMT转化，而氟尿嘧啶则不能起到相同的作用。单纯使用氟尿嘧啶或祛瘀解毒汤均可导致肿瘤细胞耐药性增强，而氟尿嘧啶联合祛瘀解毒汤处理HCT116细胞对于耐药蛋白Bcl-2的表达具有明显的抑制作用。
5.祛瘀解毒汤可能具有抑制HCT116干细胞再分化的作用。
为了更好地研究肠癌细胞的恶性生物学行为，本研究拟建立一种更能模拟体内肿瘤微环境的体外三维培养模型。考虑到经济效益及实验条件，选择使用猪结肠进行脱细胞处理，并将其应用于肠癌细胞HCT116细胞的体外培养，对于构建的脱细胞支架的一般表型进行鉴定，观测细胞在支架上的粘附、生长、增殖、凋亡等，评价该支架能否较好的支持结肠肿瘤细胞生长，进而初步探讨HCT116细胞在结肠脱细胞三维培养模型构建的微环境下的生物学表现和二维培养的差异。
在明确了猪结肠脱细胞三维支架培养肠癌细胞的可行性后，进一步探讨了三维支架诱导肿瘤细胞表达的的EMT标记物与耐药蛋白Bcl-2和二维培养相比是否存在差异。
在建立了三维脱细胞支架-肠癌细胞培养模型的基础上，进一步观察现阶段临床主要抗肠癌药物氟尿嘧啶及祛瘀解毒汤对HCT116细胞干性水平的影响，结合祛瘀解毒汤的复方优势，探究其是否能抑制HCT116细胞向EMT转化的同时，抑制HCT116CSCs发生再分化，减缓HCT116细胞的增殖进展。在药物干预HCT116细胞后，观察耐药蛋白Bcl-2的变化，探讨祛瘀解毒汤作为增加疗效、提高化疗敏感性的作用。
方法：
通过化学联合物理方法制备猪结肠脱细胞支架，观察支架的大体形态，用扫描电子显微镜观察超微结构，通过切片、H&E染色进行组织学观察评价脱细胞程度，在结肠黏膜层种植HCT116肠癌细胞，检测其存活、形态、黏附、增殖情况，从横向、纵向评价该支架对于模拟体内肠癌发展的表现，评估该支架进行细胞培养的可行性。通过免疫荧光、Western-Blot法探究，对比传统二维培养，三维支架培养对于HCT116细胞的干性、耐药性的影响。通过免疫荧光检测不同药物组对HCT116细胞表达EMT相关标记物E-cadherin、vimentin分子的影响。通过观察药物干预HCT116CSCs诱导分化后的细胞形态，探索不同药物对于肿瘤干细胞再分化的作用。通过Western-Blot法检测经不同药物组处理后，HCT116细胞的耐药分子Bcl-2的表达情况。
结果：
经过脱细胞处理后，猪结肠大体外观变成白色透明状，黏膜层明显软榻，肠壁菲薄；扫描电镜可观察到支架黏膜层的肠隐窝结构保存完整，在支架表面形成大小、分布均匀的多孔结构，孔隙的形状偏圆，较规则，孔径大小范围在40-60μm。HE染色观察到脱细胞支架仍保留清晰的四层结构，分别为黏膜层、黏
膜下层、肌层和浆膜层，无明显DNA残留。同新鲜猪结肠组织相比，脱细胞结肠组织的杨氏模量更大。
荧光显微镜下动态观察HCT116细胞在支架黏膜层的生长与活动，首先，可以观察到细胞从隐窝中逐渐增殖平铺在黏膜表层并逐渐蔓延生长成片覆盖整个黏膜层；其次，能在细胞培养第7天观察到细胞能向黏膜下层纵向生长，表现出的浸润性生长的特点。
免疫荧光结果发现，相比二维培养的HCT116细胞，脱细胞支架培养能使HCT116细胞高表达波形蛋白vimentin，低表达细胞黏附分子E-cadherin；同时，Western-Blot结果发现，与二维培养对照组相比，在脱细胞支架上培养HCT116细胞的Bcl-2蛋白水平也是明显增高的。
基于脱细胞支架三维培养，对HCT116细胞进行药物处理，免疫荧光结果发现，经药物处理7天后，单纯使用和联合氟尿嘧啶使用75mg/ml祛瘀解毒汤处理后，HCT116细胞的E-cadherin增加且vimentin表达减少，而单纯使用50μmol/L氟尿嘧啶处理后的细胞与空白对照组无明显区别。
基于三维培养条件下，观察联合不同药物组的含血清培养基诱导HCT116CSCs的分化情况发现，HCT116干细胞在不加药物或单纯加入50μmol/L氟尿嘧啶后可以再次分化，细胞形态由圆形转化为段梭形片状；加入75mg/ml祛瘀解毒汤的组别，均表现为圆润形态，聚集在支架的隐窝中，甚至有成球倾向。
在三维培养条件下，对HCT116细胞进行药物处理，Western-Blot结果发现，与空白组相比，单纯使用50μmol/L氟尿嘧啶培养或75mg/ml祛瘀解毒汤培养后的HCT116细胞的Bcl-2蛋白表达增多，而祛瘀解毒汤联合氟尿嘧啶处理后的Bcl-2表达明显减少。
结论：
1.脱细胞后，结肠黏膜层表面能观察到均匀分布的天然细胞龛洞，孔隙的大小适合细胞的种植，且该方法制备脱细胞支架能有效地完全去除核或核碎片。与脱细胞之前相比，该支架还具有更强的刚度，在拉伸断裂前可以承受更大的力。
2.猪结肠脱细胞支架提供的肠隐窝可形成的天然龛洞，对HCT116细胞能起到很好地富集作用，细胞能在支架上进行正常的生长、增殖；细胞能产生向黏膜下层纵向生长的倾向，表现出的浸润性生长的特点。
3.基于猪结肠脱细胞支架的三维培养能增强HCT116细胞的干性，诱导HCT116细胞产生更强的耐药性。
4.在使用中药干预的情况下可以抑制HCT116细胞发生EMT转化，而氟尿嘧啶则不能起到相同的作用。单纯使用氟尿嘧啶或祛瘀解毒汤均可导致肿瘤细胞耐药性增强，而氟尿嘧啶联合祛瘀解毒汤处理HCT116细胞对于耐药蛋白Bcl-2的表达具有明显的抑制作用。
5.祛瘀解毒汤可能具有抑制HCT116干细胞再分化的作用。