研究目的及依据癌症现已成为了威胁人类生命的重要因素。我国每年新增加癌症病例350万,每年因癌症死亡的人数高达250万左右。在癌症患者当中,疼痛是最常伴见症状,占癌症患者的85%-90%。在癌痛中,骨癌痛是最顽固的一种病痛。它具有痛觉超敏和痛觉过敏两个主要特征。前者是指不应引起疼痛的刺激反而产生了疼痛；而后者是是指对刺激的疼痛反应高于正常值。目前,临床上治疗骨癌痛主要是延续“三阶梯”疗法,但药物成瘾性是一个不可避免的问题。因此筛选并开发出对骨癌痛镇痛疗效高、副作用小的药物并揭示其镇痛机制成为目前备受关注的问题。CQ复方为本课题组自拟处方,具有行气活血,通络止痛的功效。对多个疼痛模型如坐骨神经痛、三叉神经痛、切口痛等也都显示出了较好的镇痛效果。大量研究表明,癌痛可能与外周传入神经敏化和中枢敏化的机制有关,外周敏化包含了肿瘤局部微环境的改变以及相关细胞因子的参与等,中枢敏化即神经元异常兴奋不断向高级中枢传导冲动,背根神经节内的胶质细胞不断合成释放神经递质,这些神经化学改变使脊髓对痛觉信息的应答增强,产生中枢敏化,并且也是疼痛维持的主要原因。本实验采用Walker-256乳腺癌细胞构建大鼠胫骨转移性癌痛模型,观察CQ复方对骨癌痛模型大鼠的行为学影响及药物对中枢神经系统谷氨酸(Glu)水平、P物质(SP)、B内啡肽(β-EP)等神经调质及肿瘤局部组织相关的细胞因子的影响,以深入了解骨癌痛的发病机制和药物在中枢以及外周神经系统发挥镇痛效用的药理学机制,为开发干预癌痛的新药奠定基础。研究方法1胫骨转移性癌痛大鼠模型的建立1.1腹水瘤细胞的制备将冻存的Walker-256乳腺癌细胞进行复苏,用生理盐水混匀制成肿瘤细胞悬液。将0.5ml肿瘤细胞悬液注入正常雌性Wistar大鼠腹腔内,待产生腹水后,抽取腹水瘤细胞并将细胞浓度调整为4.7*104个/ul。1.2大鼠分组、造模实验开始前3d,用Von Frey hairs疼痛测试包,对大鼠右侧足爪底部中外侧皮肤表面进行适应性刺激。连续3d机械痛缩足阈值大于等于26g的大鼠随机分为假手术组(sham)及手术组(surgery)。手术组大鼠暴露其右后肢胫骨内侧髁,向骨髓腔内注入4.4ul肿瘤细胞浓度为4.7*104个/ul的大鼠腹水,假手术组同方法注入4.4ul生理盐水。2模型测评方法2.1机械痛缩足阈值测评采用机械触痛法将待测大鼠放在透明罩中,适应环境后,依次用标准化的von frey纤维丝,从较小刺激强度2g开始,以每秒一次的频率,垂直刺激大鼠右后肢足爪底部中外侧皮肤表面,观察大鼠的缩足反应。记录5次中出现3次或3次以上缩足反应的最小刺激量作为大鼠的机械痛缩足阈值。造模后连续3d痛阈值小于等于8g视为模型成功。2.2自由行走痛评价术后第7d开始,将大鼠置于宽敞纸箱内,待其适应后,观察其患肢行走情况。按如下标准进行评分：0分：行为正常；1分：患肢轻度跛行,后爪接触地面,足趾不能正常外展；2分：保护体位(停步抬高患肢现象),跛行明显；3分：部分不能使用患肢,跛行明显；4分：无法使用患肢。造模前大鼠自由行走痛评分均为0分,造模后评分增加,视为模型成功。2.3影像学评价术后第13d,对大鼠进行X线摄片。根据Honore[4]的标准评分：0分：正常骨组织;1分：1～3个小点状骨破坏;2分：4～6个小点状骨破坏和髓质骨缺损;3分：部分皮质骨破坏、髓质骨缺损;4分：单侧皮质骨全层缺损;5分：双侧皮质骨全层缺损或骨折移位。造模后影像学评价有骨质破坏的视为模型成功。同时满足上述三种评价方法的大鼠入选模型。3动物分组给药及药效学测评将手术组大鼠随机分为模型组(model、 CQ高剂量组(CQ-H,200mg/kg)、CQ中剂量组(CQ-M,150mg/kg)、CQ低剂量组(CQ-L, l00mg/kg)、加巴喷丁组(gabapentin, GBP, l00mg/kg),假手术组与模型组均给予等量生理盐水,每组8只大鼠。术后第14d开始腹腔注射给药,连续7d。各组大鼠在给药的第1、3、7d测评其给药前(Omin)及给药后30、60、90、120、180、240、300min的机械痛缩足阈值。给药第7d实验结束后,腹主动脉放血处死动物,并分别取其脑脊液、右侧胫骨表面肿瘤组织和第L4-L6节段脊髓组织。4ISCUS生化法检测脑脊液中谷氨酸水平应用瑞典CMA公司的ISCUSflex检测仪及专用试剂盒,利用试剂酵素反应及呈色原理,以每种物质检品2μL以下的进样量,将脑脊液放入样品检测池中,进行自动检验分析。测量波长：365和546nnm；功率：100VA。应用Laptop计算机和LABplotTM软件控制仪器、运算数据及分析结果。5放射免疫法检测脊髓中相关神经调质采用平衡饱和加样程序将非标记抗原(被测物与标准品)、抗体、125I标记的抗原依次加入反应管中,动态平衡后加分离剂分离B(标记的抗原抗体复合物)与F(标记的抗原游离物),离心弃上清,γ-放射免疫计数仪测定沉淀的cpm值(B)并绘制标准曲线。6AimPlex检测肿瘤局部组织的相关细胞因子应用多因子检测试剂盒,将微球工作液、检测样品和标准品依次加入到检测板中,利用其与生物素标记的检测抗体和链霉亲和素标记的PE相结合的反应原理进行样品制备。应用流式细胞仪,在488nm激发光的PE通道,根据微球大小和荧光标记强弱进行检测。结合标准曲线对样品进行定量。实验流程图如下：研究结果1胫骨转移性癌痛大鼠模型的建立及评价本实验采用Walker-256乳腺癌细胞成功制备大鼠胫骨转移性癌痛模型。大鼠术后10d左右出现明显的痛域降低,12-22d行为学指标稳定,模型成功率为55%。手术组大鼠术后12d机械痛缩足阈值从术前70.00±17.77g降至5.90±2.20g,与假手术组相比显著下降(P<0.01),自由行走痛评分显著升高(P<0.05),影像学表现出骨质破坏、骨小梁消失等,表明胫骨转移性癌痛模型造模成功。2CQ复方对胫骨转移性癌痛大鼠的镇痛作用实验发现：CQ复方投予后可以明显减轻胫骨转移性癌痛大鼠的机械痛敏程度,起效时间为给药后30min,60min寸达到药效最高峰。与模型组相比CQ高剂量组在7个时间点显著升高了机械痛缩足阈值(P<0.05),且高中低剂量组之间呈量效依赖关系。加巴喷丁在90min达到药效最高峰,在6个时间点显著升高了痛域值。连续3d给药,CQ复方的镇痛作用强于第一次给药；连续7d给药,CQ复方的镇痛作用未见进一步提高。3CQ复方对胫骨转移性癌痛大鼠脑脊液中谷氨酸水平的影响对谷氨酸的检测结果表明：胫骨转移性癌痛大鼠脑脊液中谷氨酸水平显著增高,假手术组为4.78±4.00umol/l,模型组为43.78±20.OOumo1/l。CQ复方对谷氨酸的释放有抑制作用,且高中低三组之间呈量效依赖关系。CQ高剂量为12.64±3.63umol/1,对谷氨酸的抑制作用近似于加巴喷丁组。4CQ复方对胫骨转移性癌痛大鼠脊髓P物质、β内啡肽的影响模型组大鼠脊髓P物质与β内啡肽水平与假手术组相比均显著升高。CQ复方对P物质的升高有一定抑制作用,其中高剂量组P物质水平与模型组比较显著降低(P<0.05),其程度近似于加巴喷丁组。各用药组对β内啡肽水平也均显示出明显的抑制作用(P<0.01)。5CQ复方对胫骨转移性癌痛大鼠肿瘤局部组织细胞因子表达的影响对胫骨转移性癌痛大鼠肿瘤局部组织中的IL-12P70、 IFN-γ和β-NGF细胞因子检测表明：模型组大鼠肿瘤组织中IL-12P70水平下降(P<0.05),用药后升高。IFN-γ的表达在模型组有所减少,用药各组有增加的趋势,但各组间无明显差异。β-NGF水平在模型组显著升高,用药后降低(P<0.05),表明CQ复方对β-NGF有一定的抑制作用。6结论本实验采用Walker-256乳腺癌细胞成功构建了胫骨转移性癌痛大鼠模型。观察到C0复方对胫骨转移性癌痛大鼠模型在给药后300min内具有良好的镇痛效应,其强度不亚于西药加巴喷丁。进一步的机制研究提示：CQ复方的镇痛作用与抑制疼痛模型大鼠脑脊液中兴奋性氨基酸递质Glu、P物质及调整肿瘤局部相关细胞因子IL-12P70、IFN-γβ-NGF的水平有关。