研究背景铁是人体含量最多的一种必需微量元素。长期以来，对铁代谢的研究主要集中在铁缺乏/缺铁性贫血的防治。随着人们对铁代谢认识的发展，如今已经从铁缺乏扩展到机内铁过负荷的原因以及铁代谢紊乱引发的一系列相关疾病的机制探讨，尤其是铁过量与代谢性疾病之间的关系。近年来，诸多流行病学调查已经明确糖尿病，非酒精性脂肪肝等代谢性疾病患者存在铁过负荷。前瞻性研究进一步发现体内铁蛋白、转铁蛋白的升高与代谢综合征的发病率成正相关。多项META分析得出结论：机体铁含量过高是引起糖脂代谢紊乱、心血管疾病等发病的诱因之一，但具体机制尚未明确。血脂代谢的紊乱是代谢综合征的主要症状之一，血脂参数的持续异常显著增加心血管疾病的发病风险。流行病学调查显示铁过负荷人群常常伴有高脂血症，LDL-C、HDL-C等脂蛋白水平改变；动物给予单纯的高铁膳食也可见到血脂参数的异常。由于肝脏是调节脂代谢的重要器官，铁沉积于肝脏引起的氧化应激损伤是导致脂代谢紊乱的一个原因。事实上，机体铁沉积不仅仅发生在肝脏，脂肪、脑、胰腺等均有铁沉积的存在。与肝脏同样，脂肪组织是维持脂代谢平衡的重要器官。近年来，有研究证实脂肪组织是一个敏感的铁感应器官，它可以表达所有与铁代谢相关的调控、储存及转运的因子如铁蛋白、铁调节蛋白、转铁蛋白受体、HEF、hepcidin、ferroportin等。目前，脂肪组织不再是一个单纯的储脂产能组织，其分泌的细胞因子如瘦素、脂联素等对于维持机体能量和糖脂代谢的平衡具有重要的调节作用。是否脂肪组织像肝脏一样，会因为铁过负荷影响其内分泌功能，成为铁过量引起脂代谢紊乱的机制之一，这方面研究一直没见报道是个值得探索的问题。因此，本实验通过给小鼠腹腔注射右旋糖酐铁，观察血脂代谢指标的变化，并且用高通量细胞因子芯片观察血液中与脂代谢相关细胞因子的变化特点；进一步细胞实验证明不同浓度的结合型和离子型的铁干预能否直接影响脂肪细胞因子的分泌；最后在铁过负荷动物造模的同时，补充与血脂代谢最为密切的细胞因子脂联素至正常水平，检测脂联素作用的酶类活性及血脂参数的恢复情况，明确脂联素异常是否为铁过载引起的血脂异常的机制之一。研究目的观察铁过负荷小鼠血脂代谢变化以及与脂代谢密切相关的多个细胞因子的变化特点；观察铁过负荷对脂肪细胞细胞因子分泌的直接影响并证实其分泌的异常是否为铁过负荷引起血脂代谢异常的机制之一。为阐明铁过负荷引起的代谢紊乱的原因机制提供证据支持，同时也为铁过负荷引起的血脂代谢紊乱的预防和治疗方法提供一定新的思路。研究方法1.铁过负荷对小鼠血脂代谢的影响1.1实验动物小鼠铁过负荷模型的建立雄性C57小鼠（购自上海斯莱克公司），体重（20士2）g。按体重随机分为空白对照组、铁过负荷实验组，每组10只。实验组右旋糖酐铁腹腔注射2mg/d，对照组注射生理盐水，右旋糖酐铁注射总量为12mg。于第7天检测血清铁、铁蛋白、转铁蛋白饱和度、总铁结合力等血清铁相关参数；原子吸收法检测肝脏、脂肪铁含量；脂肪组织普鲁士蓝染色。1.2铁过负荷小鼠血脂参数及其他生化指标测定检测血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST等血清生化指标。血糖仪检测小鼠血糖水平。放射免疫法检测小鼠血液胰岛素水平。1.3肝脏甘油三酯合成酶类活性测定实时定量荧光PCR法检测小鼠肝脏FAS、ACC等甘油三酯合成酶mRNA水平；Western blot检测ACC酶磷酸化水平。2.铁过负荷小鼠血清各类细胞因子含量及脂肪组织细胞因子mRNA的变化2.1高通量细胞因子芯片检测血清细胞因子的改变选取IL-1β，IL-2，IL-6，IL-10，IL-15，IL-12（p70），TNF-α，IFNγ，GLP-1，GIP、Leptin，Resistin，Ghrelin，PAI-1，MCP-1，RANTES，VEGF-basic、FGF-bb、PDGF等19个细胞因子定制细胞因子芯片，检测血清含量变化。2.2Elisa重复验证芯片结果2.3检测脂肪组织中细胞因子的mRNA表达水平采用实时定量荧光PCR法测定小鼠血清中显著改变的细胞因子脂肪组织中的mRNA表达变化。3.不同浓度的结合型和游离型铁对脂肪细胞瘦素、脂联素分泌的影响3.13T3-L1细胞培养分化选用3T3-L1前脂肪细胞，DMEM培养液中加入10%小牛血清、双抗，培养箱生长。细胞接触抑制至融合后用DMEM+10%胎牛血清培养，培养液中加入胰岛素（10μg/ml）、地塞米松（1μM）、IBMX（0.5mM）分化液分化，3天后换液，完全培养液并加入胰岛素（10μg/ml）干预，每隔两天换液一次，直至8-12天分化为成熟脂肪细胞，油红O染色鉴定。3.2不同浓度的结合型铁和游离铁干预后细胞活性检测用MTT法检测不同浓度的结合型铁和游离铁干预后细胞活性情况。3.3不同饱和度的转铁蛋白结合型铁对脂肪细胞瘦素、脂联素分泌影响用不同比例的apo-transferrin/holo-transferrin配成转铁蛋白饱和度为0、25%、50%、75%、100%5个浓度梯度的混合液，干预成熟脂肪细胞24h，转铁蛋白总浓度为30μM，Elisa法检测细胞培养液中瘦素、脂联素含量，实时定量荧光PCR法测定mRNA的表达水平。3.4不同浓度的细胞外游离FeSO₄对脂肪细胞瘦素、脂联素分泌的影响用0μM，10μM，100μM，1000μM游离FeSO₄干预脂肪细胞24h，检测瘦素、脂联素mRNA水平及细胞培养液中的含量。4.外源性脂联素补充对铁过负荷小鼠血脂代谢及相关酶活性的影响4.1血清脂联素含量恢复后观察血液脂代谢变化小鼠右旋糖酐铁注射同时，腹腔注射重组脂联素，浓度为3μg/g，使其血液中含量恢复正常，检测小鼠血清中TG、LDL-C、HDL-C等血脂代谢指标变化。放射免疫法检测胰岛素水平变化。4.2甘油三酯分解酶活性的变化血清中脂联素水平恢复至正常后，比色法检测各组小鼠血清脂蛋白酯酶、肝酯酶活性变化。5.数据的统计与处理采用quantity one图像分析系统对western条带进行灰度分析，实验数据用（X±S）表示。应用SPSS11.5统计软件进行实验数据分析，两组间差异采用成组设计资料的t检验，多组间差异采用单因素方差分析。各组方差齐时，对照组与各实验组间比较采用Dunnett法，各组间两两比较采用LSD-t检验和SNK-q检验；方差不齐时采用Dunnett’s C检验。p<0.05为差别有统计学意义，p <0.01为非常显著性水平。结果1.铁过负荷对小鼠血脂的影响1.1铁过负荷小鼠机体铁状况与对照组相比，右旋糖酐铁注射小鼠血清铁、转铁蛋白饱和度（TS%）、总铁结合力（TIBC）均显著升高（p<0.01）；模型组小鼠肝脏铁水平较对照组升高4倍，脂肪组织铁含量升高5倍（p<0.01），通过普鲁士蓝染色进一步确定脂肪组织存在明显的铁沉积。1.2铁过负荷小鼠血清生化指标变化与对照组相比，铁过负荷模型小鼠血清甘油三酯水平（TG）显著升高（p<0.05）；低密度脂蛋白胆固醇酯（LDL-C）显著升高（p<0.01），高密度脂蛋白胆固醇酯（HDL-C）显著降低（p<0.01）；血糖、胆固醇（TC）、谷丙转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）没有明显改变，实验组、对照血清胰岛素水平差别没有统计学意义（p>0.05）。1.3铁过负荷小鼠肝脏甘油三酯合成相关酶ACC、FAS变化实验组肝脏ACC、FAS mRNA水平与对照组没有统计学差异（p>0.05），ACC的磷酸化水平没有明显变化。2.铁过负荷小鼠血清各类细胞因子含量及脂肪组织细胞因子mRNA变化2.1细胞因子芯片结果从芯片结果来看，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-10，IL-15，IL-12（p70），TNF-α，IFN-γ等炎性细胞因子含量与对照组没有统计学差异；GIP、GLP-1两个促胰岛素分泌细胞因子没有显著改变；生长因子和趋化因子中，实验组趋化因子RANTES显著升高（p<0.01），VEGF， FGF、PDGF、MCP-1等与对照组差别均没有统计学意义；由脂肪细胞分泌的细胞因子瘦素、抵抗素、脂联素出现显著的降低（p<0.01），PAI-1有降低趋势，但没有统计意义（p=0.27），胃底细胞分泌的Ghrelin与对照组相比显著升高（p<0.01）。2.2Elisa重复验证结果实验组小鼠血清中，由脂肪细胞分泌的脂联素、瘦素出现了显著地降低（p<0.01），与芯片结果一致。2.3脂肪组织细胞因子的mRNA水平变化实验组小鼠脂肪组织中，脂联素、瘦素的mRNA水平降低显著（p<0.01）。3.不同浓度的结合型铁和离子型铁干预对脂肪细胞细胞因子分泌的影响3.13T3-L1前脂肪细胞分化结果用完全培养液加入分化液分化三天，再用完全培养液加胰岛素干预约十天后，细胞由梭形变圆，核周围脂滴聚集，呈“戒环样”，经油红O染色鉴定前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，成熟脂滴形成。3.2不同浓度的离子型和结合型铁干预后细胞活性情况用MTT法检测后发现，最高浓度30μM的holo-transferrin和1000μM的硫酸亚铁干预后，细胞活性与对照组没有明显差异（p<0.05）。3.3不同饱和度的转铁蛋白结合型铁对脂肪细胞因子分泌的影响转铁蛋白饱和度在大于等于50%，脂肪细胞TfR-1mRNA水平出现降低（p<0.05），提示细胞内的铁含量升高；细胞中的瘦素、脂联素mRNA水平随转铁蛋白饱和度升高，逐渐降低（p<0.05）；转铁蛋白饱和度达到75%时，细胞培养液中瘦素、脂联素含量显著降低（p<0.05）。3.4不同浓度的细胞外游离FeSO₄干预影响脂肪细胞因子分泌FeSO₄干预成熟脂肪细胞后，浓度在10μM时，细胞TfR-1mRNA水平就出现了显著降低（p<0.05），细胞中瘦素、脂联素的mRNA水平随着游离铁浓度的升高，逐渐降低（p<0.05）。100μM浓度的FeSO₄干预后，细胞培养液中瘦素、脂联素含量降低（p<0.05）。4．外源性补充重组脂联素对铁过负荷小鼠血脂代谢的影响4.1铁过负荷小鼠补充重组脂联素至正常后血脂代谢参数变化外源性补充重组脂联素至正常水平后，可见血清TG的升高得到有效缓解，差别有统计学意义（p<0.05），HDL-C有升高趋势，LDL-C也有一定程度的恢复，但与对照组相比仍有统计学差异。4.2铁过负荷小鼠补充重组脂联素后血清LPL、HL酶活性变化铁过负荷小鼠血清中分解甘油三酯的脂蛋白酯酶和肝酯酶活性降低（p<0.05）；重组脂联素水平恢复正常后，脂蛋白酯酶活性较模型组显著升高（p<0.05），肝酯酶活性与实验组差别没有统计学意义。结论1.铁过负荷可引起血清甘油三酯、低密度脂蛋白升高，高密度脂蛋白降低；但对肝脏中与甘油三酯合成相关酶类没有受到影响；2.铁过负荷小鼠血液中与脂代谢密切相关的脂肪细胞因子瘦素、脂联素的含量降低，而炎性因子、趋化因子、生长因子等其他细胞因子没有变化，提示细胞因子含量的异常有可能为血脂代谢紊乱原因之一；3.细胞内铁含量升高后影响脂肪细胞瘦素、脂联素的分泌，结合整体动物脂肪组织细胞因子mRNA的结果，认为铁过负荷在转录水平影响了脂联素、瘦素的表达；4.外源性补充重组脂联素使血液中含量恢复至正常后，铁过负荷小鼠血清TG水平得到一定程度缓解，说明脂联素异常为铁过负荷导致的机体血脂代谢紊乱的机制之一；与此同时，调控血清甘油三酯分解代谢的脂蛋白酯酶活性得到一定程度的恢复；推测脂联素可能通过影响脂蛋白酯酶的活性参与了铁过载引起的血液中甘油三酯的升高。