目的:缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,IR)引起的骨骼肌损伤在临床医学和法医学实践中都很常见。骨骼肌损伤后的再生主要指卫星细胞(Satellite cells,SCs)的激活、增殖、分化、肌母细胞的延伸与融合以及新生肌管的形成,最后形成完整的骨骼肌纤维。一些转录因子比如,MyoD、myogenin均参与调控卫星细胞的增殖与分化过程和骨骼肌纤维的形成。众多实验研究发现,Ⅱ型大麻素受体(Cannabinoid type 2 receptor,CB2R)具有保护组织损伤,促进组织再生的作用。本课题组前期研究指出,在大鼠的骨骼肌挫伤后的骨骼肌细胞、肌成纤维细胞及巨噬细胞中都时序性的表达一定水平的CB2R。同时,在给予CB2R的激动剂后,肌细胞的再生明显得到改善。由此可见,CB2R对骨骼肌的再生起到促进作用。巨噬细胞是一种免疫细胞,依赖于自身高度的可塑性和异质性,可以分为两种表型状态,即经典途径活化的M1和选择性途径活化的M2。目前有文章指出,巨噬细胞对组织再生的调控主要是通过改变自身的极化来发挥不同的作用。本课题组的前期实验结果指出在皮肤损伤模型中CB2R可以改变巨噬细胞的表型,因此,本研究重点关注CB2R是不是通过改变巨噬细胞的极化表型调控骨骼肌缺血再灌注损伤后的再生。骨骼肌的再生是一个漫长复杂的过程,并且常常伴随着纤维化和瘢痕的形成,因此研究骨骼肌修复过程中的肌细胞再生和分子调控机制具有重要的现实意义。本研究利用时间梯度的骨骼肌缺血再灌注损伤模型,分析了CB2R对于骨骼肌损伤后肌细胞再生的调控作用,为临床开展促进骨骼肌再生治疗提供潜在的靶点。本研究同时分析了巨噬细胞及其分子标志物的时间表达规律,可能为法医学推断骨骼肌损伤时间提供生物学标志。研究方法:实验用8-10周的健康成年雄性的C57BL6/J野生型(Wild type,WT)和CB2R基因敲除(CB2R-KO)小鼠共72只,体重均在24g-26g。本研究利用McGiveny痣结扎器,将ORBs结扎橡胶圈套在小鼠左后肢股骨大转子上使其缺血2.5小时,此后松开橡胶圈,使血流再灌注,以此制作骨骼肌IR损伤模型。实验分为不经过损伤的对照组和经过损伤的实验组,WT和CB2R-KO小鼠各6只随机分配到各组,实验组于再灌注后1天、2天、4天、7天、10天,使用二氧化碳将小鼠麻醉后,0.9%生理盐水灌洗血流,取后肢损伤的腓肠肌作为检材。对照组于造模当天(0天)取材。腓肠肌等分为两半,一半经石蜡包埋,制作石蜡切片用于形态学染色,另一半经过液氮冷冻,液氮研磨后提取组织蛋白作分子生物学检测。H&E为普通染色;免疫组织化学检测巨噬细胞表面标志物F4/80的表达;双重免疫荧光检测F4/80和M1型标志物CD86共表达情况;F4/80和M2型标志物CD206共表达情况。Western blot检测目标蛋白MyoD、myogenin、MHC、Arg-1、IL-10、IL-13、TGF-β、Clec7a、iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达水平。利用从腹腔中分离的巨噬细胞作原代培养进行体外细胞实验。分离出来的巨噬细胞首先利用差速贴壁法培养6h,去除非贴壁细胞,留下贴壁的继续培养,并接受LPS/IFNγ或者IL-4/IL-10刺激,诱导巨噬细胞向M1或M2分型。刺激24小时后,去除培养基内刺激因素,收集一部分培养的细胞用于蛋白提取,Western blot检测Arg-1、TGF-β、Clec7a、iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α的蛋白表达。另一部分细胞继续用无血清培养基培养24小时,然后收集培养基即为条件培养基(Conditioned medium,CM)。CM与融合度达到90%的C2C12成肌细胞共培养3天,收集细胞检测MyoD、myogenin蛋白含量,免疫荧光观察成肌细胞分化情况。结果:所有的阴性对照组没有发现新生肌管。与野生型小鼠相比,CB2R敲除后骨骼肌的再生受到严重抑制,表现为新生肌管的数量虽然时序性增加,但CB2R敲除组在同时间点数量减少;新生肌管的横截面积(CSA)减小,CSA平均值减小,新生肌管表现出以小肌管为主的趋势;MyoD、myogenin的蛋白表达量显著降低。同时野生型小鼠骨骼肌内M1型在伤后1天显著增加,在2天达到高峰,此后数量逐渐减少,M2型数量在2天显著增加并于4天达到高峰,随后逐渐下降,CB2RKO组表现出相同趋势。CB2R敲除没有改变损伤区浸润的巨噬细胞总数量,但是同时间段内的2天、4天、7天,CB2R-KO小鼠相比于野生型小鼠,M1型的数量增加,M2型的数量减少,1天、10天二者没有差别。CB2R敲除导致与M1相关的标志物和促炎因子iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达水平增加,与M2相关的标志物和细胞因子Arg-1、Clec7a、IL-10、IL-13、TGF-β的蛋白表达下降。腹腔巨噬细胞原代培养实验结果显示,CB2R敲除导致巨噬细胞对LPS/IFN-γ刺激的反应性增加,促进自身向M1型极化,而对IL-4/IL-10刺激的敏感性降低,抑制自身向M2型极化。巨噬细胞条件培养基(CM)与C2C12成肌细胞共培养实验结果显示,与WT组相比,来源于CB2R敲除的巨噬细胞的CM能显著阻碍C2C12细胞的分化。结论:CB2R可以通过诱导巨噬细胞向M2极化而促进缺血再灌注损伤后的骨骼肌细胞的再生。