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本研究应用基因克隆、细胞培养、蛋白表达、共聚焦显微观察、酶联免疫测定、RT-PCR、石蜡切片等技术,在生长抑素DNA疫苗pGM-CSF/SS的基础上引入平衡致死系统,构建非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pVGS/2SS-asd,并电转化至缺失asd和crp基因的减毒猪霍乱沙门氏菌,将重组菌口服或肌注免疫小鼠后,旨在①探讨其免疫效力及影响因素;②评估其安全性,包括基因整合与毒性分析,为开发安全、高效的促生长DNA疫苗,加快其临床应用奠定基础。1.非抗性筛选生长抑素真核表达质粒的构建与鉴定以质粒pGM-CSF/SS为模板扩增生长抑素融合基因片段GS/2SS,之后亚克隆到无抗性真核表达载体pVAX-asd,构建非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pVGS/2SS-asd,同时将表达增强型绿色荧光蛋白基因（M4GFP）插入到pVGS/2SS-asd质粒的下游,构建带有绿色荧光蛋白基因的非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-M4GFP-asd。酶切、测序鉴定结果表明,基因的插入位点、方向、序列完全正确。荧光显微观察结果表明,pGS/2SS-M4GFP-asd质粒转染细胞48h后荧光最强烈,且融合蛋白GS/2SS-M4GFP定位于细胞质中。RT-PCR结果表明,pVGS/2SS-asd和pGS/2SS-M4GFP-asd质粒转染细胞48h后均能检测到转录产物。ELISA结果显示,重组质粒表达的融合蛋白均具有SS免疫学活性,表明构建的2种质粒均可在哺乳动物细胞中表达具有生长抑素免疫学活性的融合蛋白。2.非抗性筛选生长抑素DNA疫苗体外和体内的稳定性将上述构建的质粒pVGS/2SS-asd电转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500,获得非抗性筛选生长抑素DNA疫苗C500（pVGS/2SS-asd）。将重组菌体外传代培养50次后,质粒酶切鉴定结果显示,质粒在传代过程中没有丢失。将重组菌口服和肌注接种小鼠,免疫后2d在肺、脾、肝组织中可检测到重组菌,且重组菌中均可扩增出目的质粒,免疫后14d则检测不到重组菌。由此可见,以减毒沙门氏菌为载体的非抗性筛选生长抑素DNA疫苗在体内和体外均具有良好的稳定性。3.非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的免疫应答及其影响因素为优化非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的免疫程序,本研究设计三个免疫剂量(0.2×1010 CFU/只,0.2×109 CFU/只,0.2×108 CFU/只)、两种免疫次数（1次,2次）、两种免疫间隔（4w,6w）口服免疫昆明雌鼠。ELISA结果显示,试验组小鼠均可以检测到抗SS抗体,且随免疫时间的延长,呈现升高的趋势。总体比较而言,高剂量免疫一次组取得了较高的抗体水平。小鼠体增重结果显示,高剂量免疫一次组取得了相对较好的增重效果。为探讨非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的免疫应答类型,将重组菌C500（pvGS/2SS-asd）口服和肌注免疫Balb/C雌鼠,免疫剂量为0.2×1010 CFU/只。采用间接ELISA法检测血浆IgG、IgGl、IgG2a、IgA抗体水平。结果显示,口服免疫和肌注免疫均能诱导产生IgG、IgGl、IgG2a、IgA抗体,且肌注免疫诱导的抗体水平要优于口服免疫。从抗体亚型来看,不论是口服免疫还是肌注免疫产生的IgG1抗体水平均高于IgG2a,表明免疫后均可同时激发Th1型和Th2型免疫应答,但更倾向于Th2型的体液免疫应答。4.非抗性筛选生长抑素DNA疫苗在小鼠体内的表达分布将Balb/C雌鼠口服和肌注免疫重组菌C500（pVGS/2SS-asd）,剂量为0.2×1010CFU/只,分别于免疫后2d,5d,10d,20d,30d,60d,每组取4只小鼠（含1只对照）无菌采集脑、心、肝、脾、肺、肾、肠、肌肉、卵巢组织,采用RT-PCR方法检测质粒在组织内的表达时相及分布。结果显示,口服免疫后2d可以在心、肝、脾、肺、肾、肠组织中检测到目的基因,第5d时除了卵巢和脑组织之外,其它组织均可扩增到目的基因,第10d仅在肝脏中检测到靶基因。肌注免疫后2d可以在心、肝、脾、肺、肾、肌肉组织中检测到目的基因,与口服组相似的是第5d时除了卵巢和脑组织之外,其它组织均可扩增到目的条带,第10d时除了肝脏、肌肉和脾脏,其它组织均检测不到靶基因。免疫后20d两个免疫组的各个器官均检测不到目的质粒。此研究结果提示非抗性筛选生长抑素DNA疫苗在小鼠体内持续表达时间较短,且有短暂的较高水平表达之后较快被降解。5.非抗性筛选生长抑素DNA疫苗对小鼠的毒性研究将昆明小鼠口服和肌注免疫重组菌C500（pVGS/2SS-asd）,剂量为0.4×1010 CFU/只、0.4×1011 CFU/只、0.4×1012 CFU/只。免疫后4h、24h、1w、6w采血送检血常规。免疫后1w和6w采集小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、卵巢（睾丸）、肌肉组织,制备石蜡切片,观察组织是否发生病理变化。血常规检测结果显示,口服和肌注DNA疫苗后,未发现试验组和空菌对照组之间有显著性差异（p＞0.05）,石蜡切片结果显示,各个组织器官均正常,提示该疫苗没有引起小鼠毒性反应。将第3部分的试验末期Balb/C雌鼠处死后,采集心、肝、脾、肺、肾、肠、卵巢、脑、肌肉组织,提取基因组,PCR法检测质粒DNA的染色体整合情况,结果表明,在PCR的最大灵敏度（10拷贝/μg基因组）范围之内,没有发现质粒整合至基因组,提示如果发生整合突变,那么发生频率低于自发突变至少两个数量级。